不同抗原修复方法在免疫组织化学染色中的应用效果比较

段会娟

(河南科技大学第一附属医院 病理科，河南 洛阳 471003)

免疫组织化学技术已经成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力的工具，其应用范围深达医学的各个学科，是目前生命科学工作者应该掌握的基本技术之一。免疫化学实验时主要采用组织标本与细胞标本，若形态保存良好，可连续进行切片，用于各种染色观察。但是标本组织制作时甲醛的固定过程可导致细胞内抗原形成醛键、羟甲基等从而引起抗原的决定簇被封闭。在组织固定过程中，甲醛与蛋白质发生交联，可封闭抗原，因此在免疫组织化学染色后镜下观察发现阳性物反应不强，时隐时现，表达不均匀，有时可出现假阴性。因此为了较好地暴露抗原，需进行抗原修复[1]。常用的抗原修复法有微波修复法、高压加热法、酶消化法、水煮加热法等，虽然进行免疫组织化学染色可借助抗原修复程序，但是设备成本较高，手工操作法仍是较为普遍的使用方法，各个实验室会根据自身的习惯等选择不同的修复方法。基于此，本研究对比不同抗原修复方法在免疫组织化学染色中的应用效果。

1 资料与方法

1.1 材料收集河南科技大学第一附属医院2017年10月至2019年11月95例手术送检的食管癌组织标本，均经福尔马林固定，脱水后石蜡包埋。标本进行连续切片，厚度约为4 μm，并放入载玻片内(经过防脱处理)，放置于60 ℃烤箱中烤6 h左右。

1.2 试剂及仪器试剂包括CD8、CD4、Ki67、白介素-17(interleukin 17，IL-17)、pH为6.0的枸橼酸液、pH为7.2的磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)、即用型免疫组织化学SP试剂盒。所有试剂盒均选购自北京诺博莱德公司。仪器包括高压消毒锅、微波炉等。

1.3 操作方法将石蜡标本进行脱蜡水化后，置于体积分数0.3%的H2O2甲醛中浸泡10 min，氧化物活性消除后开始抗原修复。(1)高压抗原修复法：将切片放置于枸橼酸盐缓冲液(约2 000 mL)中，放置于高压锅内加热至沸腾，盖上压力阀后至喷汽后持续1～4 min，取出修复液恢复室温后，采用PBS冲洗3次，然后按照选好的免疫组织化学法进行染色。(2)水浴修复法：将盛有修复液的耐高温染色盒放置于水浴锅中，加热到95～99 ℃，加入切片(甩干水分)，采用保温档(不拧紧压力阀)，处理20 min左右，然后将染色盒与切片一起放置于冷水中进行隔水降温，冷却后，冲洗玻片上的修复液，然后进行染色处理。(3)微波辐射抗原修复法：将枸橼酸液放置于微波炉内的高温塑料切片架上，并将切片竖立其中，在微波炉内辐射20 min，取出后处理与高压抗原修复法一致。

1.4 评价指标对3种方法修复后的免疫组织化学染色结果进行分析。阳性标准为：CD8、CD4细胞膜显示棕黄色，Ki67细胞核、IL-17细胞质显示棕黄色。根据呈现的颜色进行计分：不着色计0分，深棕黄色计1分，棕黄色计2分，深棕色计3分。根据阳性细胞的百分率进行评分，其中百分率<5%为0分，5～25%为1分，26%～75%为2分，>75为3分。根据以上两项得分之和将细胞阳性程度划分为阴性(-)、弱阳性(+)、阳性(++)、强阳性(+++)，其分别为0～1分、2～3分、4～5分、6分。

1.5 统计学方法采用SPSS 23.0统计软件进行数据处理，阳性率用率(%)表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

采用高压抗原修复法修复，CD4抗体阳性率较其他两种方法高，差异有统计学意义(均P<0.05)。三种抗原修复法下CD8、Ki67、IL-17抗体阳性率对比，差异无统计学意义(均P>0.05)。高压修复法CD8、CD4、IL-17强阳性占比高于微波辐射修复法、水浴修复法(均P<0.05)。见表1。

表1 两组不同抗原修复法后免疫组织化学染色结果对比(n，%)

3 讨论

免疫组织化学染色主要利用抗原抗体的特异性原理，通过一系列的化学反应来对抗体进行显色，从而对抗原进行有效研究。其技术可将抗原的形态特点、功能等变化结合起来，可精确地反映亚细胞结构水平。但是，制作组织标本时主要采用甲醛进行固定，可造成部分抗原决定簇被封闭，因此进行染色时部分标本组织无法显色，所以需对抗原进行修复或使其暴露，恢复其原有的空间形态[2-3]。抗原修复的方法目前还未标准化，暂时还未发现任何一种抗原修复法适用于各种抗体，抗原的修复效果受到多种因素的影响，临床实际操作过程中需不断提高免疫组织化学技术水平，从而为病理诊断提供更为可靠的依据。

枸橼酸盐缓冲液pH为6.0，比较适用于大多数抗原，修复方法较多，如微波辐射抗原修复法、高压抗原修复法、水浴修复法等。微波辐射抗原修复法主要利用微波的快速运动产生的瞬间热作用来达到抗原修复的目的，微波辐射可以使各种物质分子进行极性运动，从而导致已经形成的醛键断裂，当分子间运动所产生的瞬间热达到有效的温度后，可促进甲醛固定后的蛋白变性[4]。微波辐射抗原修复法可迅速产生热力，且容易操作，该方法也较为柔和，但是液体容易干涸，因而前期准备时需要足够量的修复液，避免出现操作失误。高压抗原修复法主要利用高热来促进醛键断裂，当加上高压阀加热至沸腾，气体喷出时的温度可达到121 ℃左右，对一些较难修复的抗原修复效果较佳[5-6]。水浴法较为简单，作用较为温和，缓冲之后不易脱片，但是染色效果较差，颜色表现深浅不一，易产生假阴性，具有一定的局限性。

免疫染色是免疫组织化学技术最为关键的一步，在进行修复时标志物借助于荧光素、酶等标记抗体与组织切片或细胞涂片中相关的抗原结合，其中荧光素产生的荧光可用荧光显微镜观察，而酶通过一定的显色处理，呈现出醒目的阳性色彩，进而可较为准确地定位欲测定的抗原物质，达到诊断、鉴别诊断和研究的目的。本研究采用高压抗原修复法，CD4抗体阳性率为100.00%，而采用微波辐射修复法CD4抗体阳性率为49.47%，水浴修复法CD4抗体阳性率为43.16%，这3种方法对比，与微波辐射修复法、水浴修复法比，应用高压修复法CD4抗体阳性率较高。采用这3种方法时，CD8、Ki67、IL-17抗体阳性率差异无统计学意义，且分析染色强度可见高压修复法CD8、CD4、IL-17呈现的强阳性率高于微波辐射修复法、水浴修复法，由此可见高压修复法下组织切片多呈均匀一致的强阳性，因而定位更为准确。综合考虑，采用高压抗原修复法的效果最佳。但是，利用高压锅修复时易产生剧烈运动，可导致标本出现脱片现象，因此若3种修复方式抗体阳性率差异不大，也可选择微波辐射修复法或水浴修复法。

综上所述，采用高压抗原修复法的总体效果优于微波辐射修复法、水浴法修复，但由于实际运用时易导致脱片，因此在3种修复方式抗体阳性率差异不大的情况下，可选择微波辐射修复法或水浴法修复法，临床实际操作时需根据不同抗原修复特点选用合适的修复方法。