一起皮肤炭疽疫情的实验室检测分析

牛卫东，周鹏，安戈，李羿，赵雪蕾

(郑州市疾病预防控制中心，河南 郑州 450007)

炭疽是由炭疽杆菌引起的自然疫源性疾病，属于国家法定报告乙类传染病，其中肺炭疽按照甲类传染病管理[1]。牛、羊等食草动物为主要传染源，人类主要通过接触炭疽病畜毛皮和食肉而感染[2]。人间炭疽病例主要临床类型为皮肤炭疽，且多为散发，少数为肺炭疽和肠炭疽[3]。最新版炭疽诊断标准中，对实验室检查方面增加了炭疽杆菌特异性核酸片段检测方法，抗原检测方法以及暴露动物标本或暴露环境标本的细菌分离培养等内容[4]。本起皮肤炭疽疫情发生在2019年7月，当时依据诊断标准中对于实验室检测方面只明确了显微镜检发现特征性革兰阳性大杆菌，分离培养获得炭疽杆菌和抗体滴度升高4倍或4倍以上[5]。然而由于采样操作、抗生素治疗等原因常常会导致不能有效分离到目标病原体，因此对病例确诊造成困扰。本研究通过对本起疫情实验室检测过程进行回顾，明确核酸检测在病例确诊特别是快速诊断中的重要性，为炭疽的实验室诊断和疫情防控提供参考。

1 材料和方法

1.1 标本采集患者A(男)和患者B(女)两人为夫妻关系，两人均在郑州市某县级市从事肉牛养殖。2019年6月24日，两人宰杀病牛，6月28日发病。患者A的右手中指、左手小指以及患者B的颈部喉结部位出现红斑、丘疹、水疱，周围组织肿胀，继而形成黑色焦痂。7月2日两人至河南省传染病医院就医，被临床诊断为皮肤炭疽疑似病例。当日采集患者A的皮损渗出液标本、血清标本和患者B的血清标本；7月6日采集患者A和患者B的皮损渗出液标本、血清标本。患者C是通过传染源追踪调查发现的，他是患者A和患者B所购买病牛的卖家。患者C于6月26日前后发病，其腿部亦出现上述临床症状，在当地诊所治疗。7月9日采集患者C的皮损渗出液标本、血浆标本和痰标本。3例患者临床标本均及时送至郑州市疾控中心实验室检测。

1.2 试剂及仪器AP631株噬菌体(兰州生物制品研究所)；青霉素药敏纸片(扩散法)(Oxoid公司)；核酸提取试剂盒(天隆生物科技有限公司)；PCR反应体系(TaKaRa公司)；ELISA试剂、荧光定量PCR引物和探针均由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供。采用伯乐680酶标仪开展ELISA实验检测，采用天隆科技NP968-S型全自动核酸提取仪提取样本核酸，采用伯乐CFX96型荧光定量PCR仪开展荧光定量PCR检测。

1.3 检测方法

1.3.1常规培养 将患者皮损渗出液标本涂布接种于营养琼脂平板上，37 ℃培养24 h。挑取可疑菌落进行革兰染色镜检，并将可疑菌落致密划线接种于营养琼脂平板上，在划线区内一处滴加1滴诊断用炭疽杆菌噬菌体，另一处贴1片青霉素纸片，37 ℃培养24 h后观察结果。

1.3.2血清学检测 将待检血清最低起始稀释度稀释到1∶ 50，每孔100 μL加入平板A列，再做倍比稀释，两孔平行检测。以AVR801做标准参考血清，同时取试剂、阳性血清(AVR1749) 和阴性血清(AVR813)各做3个平行对照检测。置37 ℃湿盒中孵育60 min，甩干孔内溶液，每孔加洗涤液300 μL洗涤3次，每次3 min。各反应孔中加入1∶ 10 000辣根过氧化物酶标记抗人IgG 100 μL，置37 ℃湿盒孵育60 min，再用洗涤液洗涤3次，每孔加300 μL，每次3 min。各反应孔加入显色液100 μL，置暗处30 min。再加入显色终止液100 μL终止显色。在波长450 nm处，以空白对照孔调零后测各孔OD值。OD值大于阴性血清2.5倍定义为阳性，对应的最大稀释度定义为阳性滴度。以双份血清抗体滴度升高4倍以上或阴转阳为阳性判定标准[6]。

1.3.3荧光定量PCR检测 采用TaqMan荧光探针法检测炭疽杆菌的rpoB基因、pagA基因和capC基因[7]，引物及探针序列见表1。PCR反应体系中共20 μL，包含2×qPCR Mix 10 μL，灭菌蒸馏水7.8 μL，上下游引物和探针(均为10 μmol·L-1)各0.4 μL，模板DNA 1 μL。PCR扩增条件为95 ℃预变性30 s，95 ℃ 5 s，57 ℃ 30 s，40个循环。阳性对照采用强毒炭疽杆菌(菌株编号为201)的全基因组DNA (中国疾病预防控制中心传染病预防控制所提供)，阴性对照采用无菌纯水。阳性对照和阴性对照均成立时，Ct值<35，判为阳性；35≤Ct值<38为可疑阳性；Ct值≥38为阴性[8]。

表1 炭疽杆菌荧光定量PCR引物和探针

2 结果

2.1 培养鉴定将镜检发现的革兰阳性杆菌进行噬菌体裂解实验和青霉素抑菌实验，结果显示噬菌体裂解实验阴性，青霉素抑菌实验阳性。

2.2 血清学检测对患者A和患者B分别于7月2日和7月4日采集的血清进行了ELISA检测。患者A的血清抗体滴度由1∶ 50升高至1∶ 400，呈4倍以上升高；患者B血清抗体由阴性转为血清抗体滴度1∶ 50。据此可判定患者A和患者B为皮肤炭疽确诊病例。患者C由于未采集到双份血清，未进行ELISA抗体检测。

2.3 荧光定量PCR检测对3名患者的5份标本(3份皮损渗出液、1份血浆标本和1份痰标本)进行荧光定量PCR检测，3份皮损渗出液均检测出rpoB基因、pagA基因和capC基因，并且Ct值小于35，可判定为炭疽杆菌核酸阳性。血浆标本和痰标本均未检测出上述3个基因。3份皮损渗出液来自3例患者，证实3例患者均感染了炭疽杆菌。检测扩增结果见表2，扩增曲线见图1和图2。

表2 荧光定量 PCR检测结果

为患者A和患者B的样本荧光定量PCR扩增曲线图；B为患者C的样本荧光定量PCR扩增曲线图；a1为患者A的pagA基因，a2为患者A的capC基因，a3为患者A的rpoB基因；b1为患者B的pagA基因，b2为患者B的capC基因，b3为患者B的rpoB基因；c1为患者C的pagA基因，c2为患者C的capC基因，c3为患者C的rpoB基因；d1为阳性对照的pagA基因，d2为阳性对照的capC基因，d3为阳性对照的rpoB基因；e为阴性对照，f为患者C的血浆标本，g为患者C的痰液标本。

3 讨论

我国人间炭疽病例绝大多数是皮肤炭疽，多发生在农村地区，这主要是因为在我国大部分农村地区存在将病死畜进行剥食的现象，甚至在监管力度不够的地区有人会将病死牲畜肉拿到市场上出售或给周围亲戚朋友分食，这些情况都大大增加了炭疽传播的风险[9]。西南地区和西北地区为我国炭疽的主要发病地[10]，而河南省并不是炭疽的主要病发地，自从2002年开始河南就无关于炭疽疫情的报道[11]。

在本起皮肤炭疽疫情，实验室对所采集的患者临床标本分别采用了常规培养、血清学检测和分子生物学检测等多种方法进行检测。通过培养分离，并未得到目标病原体，但流行病学史、临床表现均指向了皮肤炭疽。尽管后期通过血清学检测，其抗体滴度变化特点可以作为确诊依据，但该检测方法周期长，容易错过早期血清采集时机，如果无其他方法辅助的话，对于病例的早期确诊并无很大帮助，很容易延误传染病疫情防控和患者的治疗。以上实验室检测结果如果按照2008年诊断标准，即通过革兰染色和显微镜检、培养分离、血清学检测等则可能会对病例的早期确诊和疫情处置带来很大困惑。本研究也表明患者住院过程中的抗生素治疗将影响目标病原体的培养、分离与检出，在采集相应标本时应尽量赶在抗生素使用之前。

在炭疽杆菌中，pagA基因是质粒PXO1中编码炭疽毒素的重要基因片段，capC基因则是质粒POX2中编码炭疽杆菌荚膜多肽抗原的重要基因片段，rpoB基因为炭疽杆菌染色体的基因片段，利用荧光定量PCR技术使得这些目的基因成功扩增，能够准确、灵敏地鉴定炭疽菌[7]。荧光定量 PCR方法相比传统的检测方法具有快速、准确的优点，一般情况下可在4 h内完成，克服了传统培养方法阳性率低和血清学检测方法周期长的缺点，为疫情防控提供快捷准确的技术支持，也为患者的临床有效治疗节省了宝贵的时间。此外，尽管炭疽杆菌与蜡样菌群的其他菌株具有高度的同源性[12]，但是通过对pagA基因、capC基因和rpoB基因片段的特异性扩增，能够将炭疽杆菌同与之相关的蜡样芽孢杆菌进行区别[11]。在本起疫情中，也通过了pagA基因、capC基因和rpoB基因片段的特异性扩增得出了确切实验室诊断结论，为查找并及时处置传染源，切断传播途径，控制易感人群提供了科学依据。

综上所述，在炭疽疫情中，如果条件允许应尽早对患者或病畜开展核酸检测，以便早期确诊病例和进行有效治疗，同时也为尽快开展疫情防控工作提供科学依据。