不同类型标本新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测结果比较

戎庭军，李雄伟，胡文坛，匡一鸣

(信阳市中心医院 医学检验科，河南 信阳 464000)

2019年12月，我国湖北省武汉市暴发新型冠状病毒肺炎(corona virus disease 2019，COVID-19)，截止2020年3月1日，中国已累计报告确诊病例80 026例，累计死亡2 912例[1]；中国境外共58个国家累计确诊7 169例，死亡104例。SARS-CoV-2属于β属的冠状病毒，为单链正义RNA病毒，主要通过呼吸道的飞沫和接触传播，通常在人类和动物中引起呼吸、消化和神经系统疾病[2-3]。冠状病毒曾引起了2次全球性传播的严重呼吸道传染病，其中1次是2003年在中国广东省发生的严重急性呼吸系统综合征(severe acute respiratory syndrome，SARS)，俗称非典型性肺炎[4-5]，另一起是2012年在沙特阿拉伯暴发的中东呼吸综合征(Middle East respiratory syndrome，MERS)[6]。但是SARS-CoV-2基因特征与SARS-CoV和MERS-CoV有区别，目前的研究显示SARS-CoV-2与蝙蝠SARS样冠状病毒(bat-SL-CoVZC45)的同源性达85%以上[7]。

对于疑似新型冠状病毒感染患者的确诊，除了有病毒性肺炎的流行病学史、临床症状和影像学特征外，SARS-CoV-2核酸阳性结果是确诊的“金标准”[8]。然而对于呼吸道疾病病毒核酸检测，标本质量直接影响检测结果的准确性。目前，临床提供用于SARS-CoV-2核酸检测的标本多种多样，常见的标本如呼吸道分泌物和支气管、肺泡灌洗液等，另外也有报道表明部分患者的粪便中也检测出SARS-CoV-2[9]，但是无论用哪种类型的标本进行SARS-CoV-2检测均有一定的假阴性率。因此，阐明不同类型标本SARS-CoV-2阳性检出率对SARS-CoV-2检测工作及COVID-19患者的确诊和治疗效果评价尤为重要。本文采用回顾性研究方法，收集了2020年2月1日至2020年3月1日在信阳市中心医院确诊和治疗的新型冠状病毒患者的咽拭子、痰液和粪便标本，采用荧光定量PCR法分别进行SARS-CoV-2核酸检测，以获得不同类型标本的SARS-CoV-2核酸阳性检出率，为SARS-CoV-2的检测工作、COVID-19患者的诊断和治疗提供帮助。

1 材料与方法

1.1 材料回顾性收集2020年2月1日至2020年3月1日在信阳市中心医院就诊治疗的COVID-19患者26例，由临床医护人员分别采集咽拭子、痰液和粪便标本保存在含有病毒保存液的样本保存管内，及时送至检验科PCR实验室进行SARS-CoV-2核酸检测。

1.2 试剂与仪器SARS-CoV-2核酸检测提取和测试剂盒(荧光PCR法)来自上海捷诺生物技术股份有限公司，ABI7500型荧光定量PCR仪购自美国Thermo Fisher公司，生物安全柜购自山东博科生物产业有限公司，恒温金属浴购自杭州博日科技有限公司，高速离心机购自湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3 SARS-CoV-2核酸检测按照SARS-CoV-2核酸提取试剂说明，向痰液标本中加入等体积乙酰半胱氨酸溶液(10 g·L-1)，混匀，室温静置30 min，再将保存于病毒保存液的咽拭子标本和粪便标本分别用一次性吸管吹打7～8次，室温静置5 min。所有标本1 000 r·min-1离心5 min，取上清液200 μL放置于1.5 mL EP管中，再加入600 μL病毒裂解液，震荡混匀，室温静置10 min，加入800 μL的上柱结合液并混匀；将混合液分2次转入到核酸提取柱内并16 000 r·min-1离心1 min，弃掉收集管中液体；向离心柱内加入700 μL清洗液，16 000 r·min-1离心1 min，弃掉收集管中液体；再向离心柱内加入300 μL清洗液，16 000 r·min-1离心1 min，弃掉收集管中液体，再16 000 r·min-1离心2 min；将离心柱放入新的收集管内，加入50 μL的洗脱液，室温静置2 min，16 000 r·min-1离心2 min，收集管中RNA溶液用于荧光定量PCR检测。按照1份反应体系13 μL PCR混合液和5 μL PCR酶溶液的比例配制PCR反应液，每孔18 μL分装到八连管中，再分别加入2 μL提取的RNA溶液，然后上机检测。PCR扩增程序：第1步反转录，42 ℃ 5 min，1个循环；第2步预变性，95 ℃ 3 min；第3步循环扩增，95 ℃ 10 s，60 ℃ 31 s，40个循环，在58 ℃检测荧光信号。检测SARS-CoV-2基因组中的开放读码框1ab(open reading frame 1ab，ORF1ab)及编码核衣壳蛋白(nucleocapsid protein，N)基因，根据试剂盒说明书提供的结果解释，CT值小于37判定为阳性，CT值大于40或无判定为阴性，CT值在37和40之间需要复查，以1份样本中ORF1ab和N基因双阳性或2次采样ORF1ab基因均阳性判定为SARS-CoV-2阳性，否则判定为SARS-CoV-2阴性。

1.4 统计与分析采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理，计量资料用中位数表示，计数资料用百分比表示，3组间阳性检出率比较采用Cochran’sQ检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

26例患者中，男12例，女14例，年龄27～73岁，中位年龄47.5岁。在26例患者的咽拭子标本中，检测出SARS-CoV-2核酸阳性的为18例，阳性率为69.23%；痰液标本中检测出SARS-CoV-2核酸阳性的为25例，阳性率为96.15%；粪便标本中检测SARS-CoV-2核酸阳性为2例，阳性率为7.69%。2例粪便标本阳性的患者咽拭子与痰液标本结果也均为阳性；1例痰液标本阴性的患者其咽拭子结果为阳性，粪便标本结果为阴性；8例患者痰液标本为阳性，咽拭子和粪便标本结果均为阴性，15例患者粪便标本结果为阴性，痰液和咽拭子标本均为阳性，具体数据见表1。RT-PCR检测结果显示，痰液标本阳性率最高(96.15%)，咽拭子标本阳性率次之(69.23%)，粪便标本中阳性率最低(7.69%)。痰液标本SARS-CoV-2核酸阳性检出率高于咽拭子和粪便标本阳性检出率，差异有统计学意义(均P<0.05)。

表1 26例患者一般资料及核酸结果

3 讨论

目前对于疑似COVID-19患者主要是取咽拭子标本[10-11]，利用RT-PCR技术进行SARS-CoV-2核酸检测；然而许多患者确诊需要多次咽拭子标本核酸检测，甚至造成漏诊，其中咽拭子采集者的操作水平、检验试剂、检验人员水平、标本的运输保存等均对结果造成影响，但是对于标本类型的选择影响不可不考虑。本研究主要目的是利用荧光PCR技术比较同一患者不同标本中SARS-CoV-2核酸检出率，所有纳入研究的病例均为确诊病例。本研究结果表明，26例COVID-19患者的不同类型标本中，痰液标本SARS-CoV-2核酸阳性检出率最高，为96.23%，咽拭子标本核酸阳性检出率为69.23%，粪便标本阳性率检出率最低，仅为7.69%。这表明对SARS-CoV-2核酸进行检测，痰液标本阳性率明显高于咽拭子和粪便标本的阳性率。

SARS-CoV-2在痰液标本中阳性检出率更高，一方面可能是因为临床咽拭子采集的不规范、不标准，另一方面也可能因为该病毒主要侵袭和感染下呼吸道细胞，病毒在下呼吸道的水平远高于上呼吸道，且当患者体内病毒水平较低时，咽拭子标本很难采集到足够的病毒。因此，在诊断疑似患者和评估确诊患者治疗效果时，下呼吸道标本中痰液较咽拭子和粪便更加适合于病毒核酸检测。

本研究仍有许多局限性：首先，纳入研究的确诊患者只有26例，下一步需要更多的数据来进行更深入的研究；其次，仅研究了痰液、咽拭子和粪便3种类型标本的病毒核酸阳性检出率，没有对血清、血浆、支气管灌洗液、肺泡灌洗液、尿液等标本进行研究；最后，虽然痰液标本的病毒核酸阳性检出率最高，但是部分确诊患者并不产生痰液，这将导致痰液标本的采集十分困难。

总之，在利用RT-PCR技术检测SARS-CoV-2核酸时，痰液标本阳性检出率明显高于咽拭子和粪便标本。建议对疑似COVID-19患者，首先应该采集痰液标本进行SARS-CoV-2核酸检测，如无法采集到痰液，才可选择咽拭子标本，这将有利于疑似患者的确诊，提高临床诊断的准确性。