mTOR信号通路相关分子在肺鳞癌组织中表达的意义

王昕晨 黄燕燕 陆畅畅 周吉航 何剑营 方可欣 乐涵波 续力云

肺癌是全球常见的恶性肿瘤之一，在肺癌的组织学分类中，肺鳞癌占了较大比例[1]。目前肺鳞癌患者的靶向治疗靶点非常有限[2]，因此，寻找肺鳞癌相应的治疗靶点成为学者们研究的热点。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白酶，从酵母到哺乳动物均广泛存在。它作为一种主要的生长调节分子，可以感受并结合氨基酸、营养物质、生长因子和环境信号等，以调节细胞各个过程，包括蛋白质合成、生长、代谢、衰老、再生、自噬等。目前发现mTOR信号通路与肿瘤的发生与发展关系密切，例如在宫颈癌[3]、结肠癌[4]等恶性肿瘤中表达变化明显。本研究对mTOR信号通路相关分子在肺鳞癌组织中的表达情况及其与临床病理特征及生存期的相关性作一探讨，以期为治疗肺鳞癌提供新的靶点。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2010年6月至2017年12月在本院经手术病理检查证实的肺鳞癌标本共93例。患者手术前均未接受放疗或化疗。收集患者病史资料，如年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤位置、分化程度、浸润深度、淋巴结转移、远端转移、肿瘤淋巴结转移（TNM）分期等。肿瘤组织学分级是以2004年WHO肺癌组织学分类为基础。按照国际抗癌联盟倡导的TNM进行分类。所有标本均经2位病理学主任医师明确诊断。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 主要试剂 mTOR抗体（1:2 000）、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（phosphorylated mammalian target of rapamycin，p-mTOR）抗体（1:2 000）、P70核糖体蛋白 S6激酶（ribosomal protein S6 kinase，p70S6K）抗体（1:2 000）、10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN）抗体（1:25）、真核细胞翻译起始因子 4E 结合蛋白 1（4E blinding protein1，4EBP1）抗体（1:2 400）、磷酸化真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1（phosphorylated 4E blinding protein1，p-4EBP1）抗体（1:2 000）均购于美国Cell signaling technology公司，磷酸化P70核糖体蛋白S6激酶（phosphorylated ribosomal protein S6 kinase，p-p70S6K）抗体（1:2 000）购于美国Santa Cruze biotechnology公司。

1.3 肺鳞癌组织中mTOR信号通路相关分子检测 采用免疫组化方法。收集石蜡包埋组织后置于切片机中进行连续切片。石蜡切片脱水脱蜡后，在柠檬酸缓冲液中进行热修复，3% H2O2室温孵15 min，以消除内源性过氧化物酶的活性。正常山羊血清封闭15 min后，分别滴加相应的抗体；另外，用PBS缓冲液替代上述抗体作为阴性对照。用免疫组化试剂盒（中杉金桥生物技术有限公司）进行二抗孵育，DAB显色，之后用苏木精对玻片进行染色，最后用树脂封片。免疫组化结果采用双盲显微镜进行判断。染色强度分为 0（无）、1（弱）、2（中）、3（强）。阳性细胞所占比例为 0（无染色）、1（＜1/4染色）、2（1/4～3/4染色）、3（＞3/4染色）。组织学评分是细胞阳性强度和阳性细胞所占比例的乘积。免疫组化染色结果分为两组，0～2为低表达病例组，＞2为高表达病例组。如出现结果不一致，则由第3位病理学医师读片后判断结果。

1.4 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件。计数资料的比较采用字2检验和Fisher精确概率法。患者整体生存期（OS）采用GraphPad prism 5软件，用Kaplan-meier法进行计算。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 mTOR信号通路相关分子表达水平与肺鳞癌临床病理特征的关系分析 在肺鳞癌中，对mTOR信号通路分子与临床病理特征进行单因素分析显示，和低表达病例组相比，4EBP1高表达病例组在有淋巴结转移所占比例为47.5%（29/61），而4EBP1低表达病例组在有淋巴结转移中所占比例仅为12.5%（4/32），差异有统计学意义（P＜0.05），且4EBP1高表达病例组中分期大于域期的比例较高（P＜0.05）；而该分子的表达水平在性别、是否吸烟、癌胚抗原水平、胸膜是否侵犯、肿块直径大小等临床病理特征中，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。和高表达病例组相比，PTEN低表达病例组在肿瘤直径＞3 cm的比例较高，差异有统计学意义（P＜0.05），见图1（插页）；而该分子高表达在性别、是否吸烟、CEA水平、胸膜是否侵犯、淋巴结是否转移等病理特征中，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。而p-mTOR、mTOR、p-4EBP1、p70s6K信号分子的表达水平在不同临床病理特征中差异均无统计学差异（均P＞0.05）。见表1。

图1 肺鳞癌组织中10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物（PTEN）和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1（4EBP1）的表达（a：PTEN在肺鳞癌组织低表达；b：PTEN在肺鳞癌组织中高表达；c：4EBP1在肺鳞癌组织低表达；d：4EBP1在肺鳞癌组织高表达；DAB染色，×400）

表1 mTOR相关分子与肺鳞癌患者临床病理特征的关系[例（%）]

表1 mTOR相关分子与肺鳞癌患者临床病理特征的关系[例（%）]

2.2 肺鳞癌中mTOR信号通路相关分子的表达水平与生存时间的关系 与低表达病例组比较，p-mTOR信号分子高表达病例组的OS（35.0个月比75.0个月）明显缩短，差异有统计学意义（P＜0.05），见图2；而mTOR、p-4EBP1、4EBP1、p-p70s6K、p70s6k、PTEN 信号分子的表达与肺鳞癌患者OS均无统计学差异（均P＞0.05）。

图2 磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的表达与肺鳞癌患者生存期的分析

3 讨论

肺癌是当今全球常见的恶性肿瘤之一，而且近年来其在全世界的发病率和死亡率呈现不断上升趋势[5]，5年生存率仅为15%[6]，肺鳞癌又是肺癌中常见的组织学类型，随着分子生物学研究的不断进展，针对相应靶点的分子靶向药物已经取得较好的疗效[7]。探索肺鳞癌的分子生物学机制不仅可以提高临床治疗的效果，而且对肺鳞癌的早期诊断、临床分期、预后判断有着重要的作用。

mTOR编码的大分子蛋白由2 549个氨基酸组成，分子质量289 kDa，其定位于人类1号染色体短臂（1p，36.2），mTOR是在分析不同啤酒酵母突变体对雷帕霉素抵抗作用的差异时发现，在各种真核生物细胞中广泛存在。它是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于磷酸肌醇激酶家族成员，在协调细胞生长和细胞死亡之间的平衡中扮演着至关重要的角色[8]。近年来，mTOR信号通路被发现在多种恶性肿瘤中如乳腺癌、胃癌、肺腺癌的发生、发展中起着重要的作用[9-11]。

本研究中93例肺鳞癌组织分别用mTOR信号通路的 7种相关抗体（p-mTOR、mTOR、p-4EBP1、4EBP1、p-p70s6K、p70s6K、PTEN）进行免疫组化染色，通过各种抗体的表达水平探讨其与肿瘤的关系。PTEN蛋白，它是一种早期发现的抑癌基因[12]，具有磷酸酯酶的活性，可通过酪氨酸激酶等磷酸化酶的活性从而抑制肿瘤的发生与发展[13]。董杰等[14]发现，PTEN在上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率低于卵巢良性肿瘤，玉～域期上皮性卵巢癌组织中的阳性表达率明显高于芋～郁期上皮性卵巢癌组织。徐晓燕等[15]在对肺腺癌的研究中发现，肺腺癌组织中PTEN蛋白的表达显著低于正常肺组织。本研究结果表明，在肿瘤直径＞3 cm的组织中，89.1%患者PTEN呈明显低表达，提示PTEN的低表达与肿瘤的生长有关。

4EBP1是mTOR信号通路激活后的关键下游调控因子，是目前研究最为广泛的底物[16]，相对分子量为21 000，位于染色体8 p11.23位点上，属于真核细胞翻译起始因子4E（eIF4E）依赖性翻译的负调控因子家族，是促使核糖体招募mRNA的因子[17]，4EBP1通过与eIF4E结合使eIF4E的活性受到抑制，进而抑制蛋白翻译的起始，4EBP1磷酸化促使两者分离，失去对eIF4E的抑制作用，进而促进蛋白质的翻译的起始。朱旭明等[18]通过免疫组化法对宫颈癌的研究后发现，4EBP1在细胞中的染色程度、阳性细胞染色比例随着宫颈病变程度的加重而升高。在本研究中，4EBP1在有淋巴结转移的患者中阳性比例显著增加，结合以上资料说明4EBP1与肿瘤生长和转移有一定的关联作用，但如何促进转移，需要进一步研究。

mTOR信号通路相关信号分子促进恶性肿瘤的生长和转移主要是通过其磷酸化后的活化形式进行的，p-mTOR就是其主要的活化产物。Guo等[19]报道在上皮性卵巢癌（EOC）中，p-mTOR的蛋白水平明显高于其它组，同时，p-mTOR的高表达是预测EOC患者预后不良的重要因素。Cao等[20]通过Western blot和逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）以及免疫组织化学法检测胃癌组织中mTOR相关蛋白的表达，结果表明，mTOR蛋白水平的表达虽高于正常胃黏膜但无统计学差异，而p-mTOR在肿瘤组织中的表达比例明显升高具有统计学意义，mTOR信号通路被激活，主要是通过mTOR磷酸化的增加，而非去磷酸化mTOR的过表达，该学者对胃癌患者的生存期研究后亦发现，p-mTOR高表达与生存时间较短相关。本研究发现，p-mTOR高表达的患者生存期较短，这与Cao等[20]研究相符。李红等[21]发现加入p-mTOR的抑制剂能够促进CD8+记忆细胞前体细胞的形成，获得更多年轻化的T细胞，增加机体的免疫功能。

这些资料说明作为mTOR信号通路磷酸化后重要的活性形式，p-mTOR的过度表达在肺鳞癌的发生、发展中起着一定的作用，同样作为mTOR信号通路下游分子的4EBP1，也与肺鳞癌的淋巴结转移有着重要的关系。PTEN蛋白的高表达抑制了恶性肿瘤生长的能力，说明PTEN的异常表达可能在肿瘤的发生与发展中具有重要作用。而在本研究中mTOR、p-4EBP1、p-p70s6K、p70s6k这4种mTOR信号通路相关蛋白与肺鳞癌的发生转移、患者的生存期无统计学意义，这与一些报道不符，这可能与样本数过少有关，需要加大样本量。

综上所述，本研究发现mTOR信号通路与肺鳞癌的发生、发展具有相关性，为探讨其在肺鳞癌中的作用提供了临床数据支持，将为肺鳞癌的相关研究开辟新的途径以及寻找新的药物作用靶点提供重要支持。