布加综合征模型大鼠缺氧相关因子与表观扩散系数的变化及临床意义

朱楠 张甜甜 成德雷

布加综合征（Budd-Chiari syndrome，BCS）的本质是肝静脉（hepatic vein，HV）回流受阻导致的淤血性肝损伤，若不经治疗，最终会进展为肝硬化[1-2]。研究发现，在BCS的病理损伤中，缺氧诱导因子-1琢（hypoxia-inducible factor-1琢，HIF-1琢）、NF-资B 扮演重要角色，其参与调节BCS肝损伤中肝星型细胞活化，从而影响细胞外基质沉积、微循环灌注等情况，这些均表现为细胞内外水分子弥散变化，从而改变MRI表观扩散系数（apparent diffu原sion coefficient，ADC）的水平[3-5]。在评估脂肪肝、乙肝后肝硬化等肝损伤中已有ADC值应用的报道，但在BCS中的研究为数不多[6]。因此，本研究参考文献[3]结扎下腔静脉（inferior vena cava，IVC）建立下腔静脉梗阻型BCS模型大鼠，并动态检测肝脏ADC值与HIF-1琢、NF-资B水平的变化，初步探讨其在BCS肝损伤中的临床意义。

1 材料和方法

1.1 实验动物及分组、建模 135只体重235～305 g的健康雄性SD大鼠购自安徽省立医院动物实验中心，在12 h明/暗交替光照下，温度15～25益，湿度50豫～60豫条件下清洁饲养。按随机数字表法分组：（1）对照组15只，仅常规饲养；（2）模型组 60 只（分为第 1、4、8、12 周亚组，每组15只），于剑突下正中开腹分离肝镰状韧带，暴露肝后段IVC，用3 F微导管平行紧贴IVC，并以0号线环绕结扎IVC后将微导管抽出，结扎IVC松紧度适中，逐层缝合关腹（图1，见插页）；（3）假手术组60只（分为第 1、4、8、12周亚组，每组 15只），开腹后未结扎肝后段IVC，仅作切口缝合。

图1 模型组结扎下腔静脉（IVC）示意图

1.2 MRI及DSA检查 MRI检查：使用GE HDXT-1.5T磁共振机。对照组于第12周末，模型组及假手术组分别于建模后第1、4、8、12周末随机取9只大鼠，晨起停饲，常规麻醉后，取仰卧位，腹部加压固定于腕关节线圈中心，扫描参数为TR 1 250 ms，TE 65 ms，FOV 55 mm伊55 mm，层间距 0.2 mm，层厚 3.0 mm，反转角90毅，激励次数 8，矩阵 192伊192，行常规 T1WI、T2WI序列检查及仰卧轴面DWI检查。b值取800 s/mm2，自旋回波-回波平面成像加脂肪抑制。测量ADC值，感兴趣区（ROI）大小约 15耀20 mm2，尽量避开胆管、血管及肝脏边缘，取3个ROI测得数值的平均值。DSA检查：各组大鼠于MRI检查后1 d行DSA，于任意一侧下肢消毒、铺巾，以21 G静脉留置针穿刺股静脉，注射对比剂观察IVC血流情况。DSA检查后1 d，麻醉下开腹处死大鼠，取肝脏作下述检查。

1.3 常规病理检查及免疫组化检测 取MRI测量ROI相应层面的新鲜肝组织适量，用10%福尔马林固定24 h，石蜡包埋，制作组织切片，HE染色后行常规病理学检查。并以PicTureTM法（PicTureTM检测试剂，美国Zymed公司）行免疫组织化学染色：石蜡切片脱蜡水化，3% H2O2室温孵育5～10 min后PBS（ZSbio公司）冲洗。滴加一抗[兔抗 HIF-1琢（1:300）、兔抗 NF-资B（1:300）]，室温孵育30～60 min后PBS冲洗。滴加通用型IgG抗体（Fab段）-HRP多聚体，室温孵育10～20 min后PBS冲洗，应用DAB溶液显色，蒸馏水冲洗、复染、脱水、封片。以PBS代替一抗作为阴性对照，采用已知阳性片作为阳性对照，阳性表达为结构清晰的细胞质棕黄染色。

1.4 肝组织HIF-1琢、NF-资B的mRNA表达检测 肝组织液氮研磨后加入1 ml TRIzol匀浆，严格按照说明书步骤提取总RNA，提取出的RNA逆转录合成cDNA（RevertAidTM逆转录试剂盒，美国Thermo Scientific公司），然后行 real-time PCR 检测 HIF-1琢、NF-资B 的mRNA表达水平。PCR反应条件：95益2 min；95益5 s，60益10 s，40个循环。引物序列（上海生工生物工程股份有限公司）如下：茁-actin 上游序列：5忆-CCCATCTAT原GAGGGTTACGC-3忆，下游序列：5忆-TTTAATGTCACG原CACGATTTC-3忆；HIF-1琢 上游序列：5忆-TGACCACTGC原TAAGGCATCA-3忆，下游序列：5忆-GGCTCCTTGGAT原GAGCTTTG-3忆；NF-资B 上游序列 5忆-AAGATCTGCC原GAGTAAACCG-3忆，下游序列：5忆-TCCCGTGAAATA原CACCTCAA-3忆；基因相对表达量以 2-吟吟Ct计算。

1.5 肝组织HIF-1琢、NF-资B蛋白表达检测 肝组织细胞裂解、离心后收集上清液，按照1:4加入5伊SDSPAGE蛋白上样缓冲液。沸水浴加热10 min，冷却到室温，上样到SDS-PAGE胶加样孔内，每孔5～20滋l。浓缩、分离后300 mA恒流转膜90 min。漂洗5 min，室温封闭 2 h。一抗[兔抗 HIF-1琢（1:300）、兔抗 NF-资B（1:300）]4 益孵育过夜，加入洗涤液（PBST），10 min/次，共 3次，相应二抗（山羊抗兔，1:5 000）室温孵育2 h。加入PBST洗涤液，10 min/次，共3次。使用ECL超敏发光试剂盒（美国Thermo Scientific公司）检测蛋白表达水平，以Image J软件分析条带灰度值，HIF-1琢、NF-资B的蛋白相对表达量依照内参照结果计算。

1.6 统计学处理 采用SPSS 22.0统计软件。正态分布的计量资料以±s表示，多组间比较采用两因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验，各指标间相关性分析采用Pearson相关。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BCS模型大鼠建立情况 对照组存活15只，假手术组第 1、4、8、12 周亚组分别存活 15、14、15、15 只，对照组及假手术组大鼠活动如常、反应机警，毛色光亮，DSA检查均无阳性表现。模型第1、4、8、12周亚组分别存活13、14、13、13只，存活大鼠均成功建立BCS模型，模型组大鼠术后活动逐渐减少、反应迟钝，毛色灰暗，肝后段IVC管腔明显变窄，远端扩张，4周后逐渐见侧支循环形成（图2）。

图2 模型组第12周DSA检查所见[肝后段IVC管腔狭窄（短箭头所示），远端扩张，见广泛侧支循环形成（长箭头所示）]

2.2 各组大鼠MRI表现 各组大鼠常规T1WI、T2WI扫描肝实质信号均匀，肝表面光整（图3）。对照组与假手术组ADC值比较，总体差异无统计学意义（F=0.282，P=0.889）；对照组 ADC值高于模型组（F=14.213，P=0.001）；模型组ADC值低于假手术组（F=13.145，P=0.001）。模型组ADC值呈现先下降后升高的趋势，在模型组内各亚组整体比较，差异有统计学意义（F=11.275，P=0.001）；各亚组间两两比较，第1周亚组与第4周亚组、第1周亚组与第8周亚组、第4周亚组与第12周亚组间差异均有统计学意义（均P=0.001），其中以第4周亚组ADC值最低，见图4（插页）、表1。

2.3 各组大鼠HIF-1琢的mRNA及蛋白表达水平的比较 对照组各时点HIF-1琢的mRNA及蛋白表达水平均低于模型组（F=985.298、774.482，均 P=0.001），与假手术组比较差异均无统计学意义（F=1.217、0.653，P=0.315、0.627）。模型组各时点HIF-1琢的mRNA及蛋白表达均高于假手术组（F=563.814、878.432，均 P=0.001），并呈先升高后下降，各亚组间的差异均有统计学意义（F=864.961、372.287，均 P=0.001），其中以第 4 周亚组最高，见图 5、表 2。

2.4 各组大鼠NF-资B检测结果的比较 对照组NF-资B的mRNA及蛋白表达水平均低于模型组（F=376.254、682.548，均P=0.001）；与假手术组比较差异均无统计学意义（F=0.820、0.842，P=0.518、0.505，表 3）。模型组各时点HIF-1琢的mRNA及蛋白表达均高于假手术组（F=378.146、685.152，均 P=0.001），并呈先升高后下降，各亚组间的差异有统计学意义（F=248.165、347.134，均P=0.001），其中以第4周亚组最高，见图5、表3。

2.5 各指标间相关性分析 模型组ADC值与HIF-1琢、NF-资B 呈负相关（r=-0.709、-0.717，均 P=0.001）；HIF-1琢与 NF-资B 呈正相关（r=0.901，P=0.001），见图 6-8。

2.6 常规病例检查及免疫组化检测 对照组（图9a，见插页）及假手术组（图9b，见插页）大鼠观察至第12周HE染色均未发现明显肝组织损伤。模型组（图9c，见插页）大鼠肝脏病理损伤程度逐渐加重，12周亚组最显著，可见肝索破坏、肝细胞变性、萎缩、坏死，肝窦扩张、红细胞淤积等。对照组及假手术组观察至第12周的HIF-1琢、NF-资B 免疫组化均无阳性染色（图 10a～d，见插页）；模型组HIF-1琢、NF-资B阳性染色呈棕黄色，均以第4周最显著，主要分布于肝窦周细胞、汇管区间质细胞、血管内皮细胞和纤维组织（图10e～f，见插页）。

图3 各组大鼠肝脏T1WI图像（a：对照组第12周；b：假手术组第12周；c：模型组第12周）

表1 各组大鼠ADC值比较（×10-3mm2/s）

图4 模型组肝脏表现扩散系数（ADC）伪彩图

图5 各组大鼠缺氧诱导因子-1琢（HIF-1琢）、NF-资B蛋白表达电泳图

表2 各组大鼠HIF-1α的mRNA及蛋白表达水平的比较

图6 缺氧诱导因子-1琢（HIF-1琢）与表观扩散系数（ADC）值相关性

图7 NF-资B与表观扩散系数（ADC）值相关性

图 8 缺氧诱导因子 -1琢（HIF-1琢）与NF-资B 相关性

图9 各组大鼠肝脏组织常规病理检查所见（a：对照组第12周；b：假手术组第12周；c：模型组第12周；HE染色，×200）

图10 各组大鼠肝组织免疫组化检测所见[a：对照组第12周缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）；b：假手术组第12周HIF-1α；c：对照组第12 周 NF-κB；d：假手术组第 12 周 NF-κB；e：模型组第 4 周 HIF-1α；f：模型组第 4 周 NF-κB；免疫组化染色，×200]

3 讨论

DWI是反映水分子布朗运动情况的一项MRI检查技术，其通过反映出组织间隙水分子扩散的改变，反映出肝损伤过程中细胞外间隙的变化信息，ADC值是其主要参数[6]，可以先于肝硬化形态学的变化，帮助早期判断BCS肝脏损伤情况[5]。BCS是肝静脉回流障碍导致的肝脏淤血缺氧损伤，其最终转归为淤血性肝纤维化[1]。研究发现[3-4]HIF-1琢、NF-资B参与BCS肝损伤，其可造成肝细胞水肿、肝微循环障碍、细胞外基质沉积等，进而导致细胞内外水分子和肝脏灌注的改变，从而反映在ADC值的变化[5-6]。本研究建立大鼠BCS动物模型，在BCS病程的多个时间点检测了ADC值、HIF-1琢、NF-资B的变化，发现3者呈现一定的变化规律，提示其存在相关性，并可从一定程度上反映BCS肝脏淤血缺氧的严重程度。

HIF-1琢是调节细胞对缺氧反应的转录因子，其在缺氧期间可呈现高表达，进而诱导肝脏淤血缺氧损伤[7-8]。NF-资B是与免疫球蛋白K轻链基因增强子B位点特异性结合的核蛋白因子，缺氧时，可调节肝细胞、Kupffer细胞和肝星状细胞在各种类型的肝损伤及肝纤维化中发挥作用[9]。本研究发现模型组各时间点HIF-1琢、NF-资B水平均高于对照组及假手术组，且呈正相关，提示其可能相互调节并参与了BCS模型肝损伤的进展。但模型组HIF-1琢、NF-资B水平并未持续升高，而是先升后降（第4周最高），这不同于其他原因肝病中随肝损伤进展持续上升的报道[8，10-11]，说明其诱导BCS肝损伤的机制与其他类型肝病有所不同，可能是肝脏淤血缺氧后上调HIF-1琢表达，激活其下游TGF-茁1、PDGF-B等促纤维化信号转导和上皮间质转化，上调NF-资B合成、释放，进而诱导肝脏氧化应激损伤，致使其在第4周表达水平最高[10，12]；4周后，侧支循环逐渐形成，缓解门静脉压力及淤血缺氧，从而下调HIF-1琢、NF-资B水平，但其始终高于正常，且肝脏病理损伤仍缓慢进展，说明仅靠侧支循环无法从根本解决BCS淤血性肝损伤[13]。

本研究发现，模型组ADC值低于对照组及假手术组，说明BCS肝组织存在水分子弥散受限；模型组的ADC值先下降后上升（4周最低），这不同于脂肪肝、乙肝后肝硬化等肝病中随肝损伤进展持续下降的报道[14-15]，这可能是因为随着IVC结扎时间延长，前4周肝淤血缺氧加重，肝静脉回流受阻导致微循环障碍，减弱水分子扩散能力和微循环灌注，肝细胞线粒体肿胀[5]，同时氧化损伤蛋白质、DNA生物大分子，改变细胞膜的流动性和通透性，降低ADC值[5，16]，故而4周时ADC值最低，表现出与HIF-1琢、NF-资B呈负相关。另一方面，肝淤血缺氧后引发HIF-1琢持续高表达及氧自由基增加，激活NF-资B及TGF-茁1信号，导致其下游靶基因的激活和HSC的活化，上调PDGF-B等因子的表达，抑制ECM降解[10-12]，加重门静脉高压、肝细胞肿胀、肝窦淤血，影响水分子扩散，从而降低ADC值，以上提示BCS肝淤血缺氧损伤程度与ADC值密切相关。

模型组在4周后逐渐建立侧支循环，减轻门静脉压力，缓解淤血缺氧及氧化应激，下调HIF-1琢、NF-资B表达[10-12]，提示侧支血管从一定程度上缓解了肝脏淤血缺氧及微循环障碍，改善细胞外基质沉积及水分子扩散，从而升高 ADC值，并下调HIF-1琢、NF-资B水平，这提示ADC值与HIF-1琢、NF-资B呈负相关，3者的变化均与淤血缺氧程度密切相关。然而，4周后模型组的HIF-1琢、NF-资B水平虽有下调，ADC值虽升高，但始终未达到正常水平，说明侧支循环虽部分缓解了BCS淤血缺氧，但病理损伤仍随IVC结扎时间延长而缓慢进展，这与大量临床报道相符[1，13]，说明只有介入开通梗阻静脉才是治疗BCS的根本手段。

本研究的局限性在于大鼠肝脏体积较小，呼吸运动及肺底和腹腔气体等均可能影响ADC值及病理取材的准确性。另外，大鼠生命周期有限，尚无法完美模拟人类中长达数十年的BCS病程。

综上所述，IVC阻塞后随着肝脏淤血缺氧进展，ADC值与HIF-1琢、NF-资B在BCS动物模型中的肝脏中呈负相关，3者均与淤血缺氧程度密切相关，可作为无创评估BCS肝损伤的一个新的选择。