硫化氢荧光探针的研究进展*

周学文，吴莎莎，李向华，黄胜堂，王小波

(湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100)

硫化氢(H2S)是人体内继NO和CO之后发现的第三种内源性气体信号分子。它主要由L-半胱氨酸通过酶解反应产生，这些酶包括胱硫醚-β-合成酶(CBS)、胱硫醚-γ-裂解酶(CSE)、3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-MST)和半胱氨酸氨基转移酶(CAT)[1]。H2S生理浓度介于1nmol与1mmol之间不等，它参与一系列生理调控活动，如调节血管舒张、神经传导、心肌收缩、细胞凋亡、炎症、缺血再灌注损伤及胰岛素分泌等[2]。H2S因具有还原性而常作为体内活性氧(ROS)和活性氮(RNS)的清道夫，细胞一旦无法维持正常的H2S浓度，则可能会导致阿尔兹海默式症、唐氏综合征、胃黏膜损伤、高血压和肝硬化等疾病[3]。

目前，用来检测体内(血浆或匀浆组织)H2S的方法有比色法、电化学分析法、色谱分析法和金属硫化物沉淀法等[4-7]，而这些方法有一个共性的弊端，即通常需要对实验对象进行预处理，如组织匀浆和细胞破碎。近年来兴起的荧光探针检测法能很好地克服上述方法的不足而实现原位检测；同时，荧光分析本身具有很高的灵敏度，理论上可以达到单分子检测水平。基于此，近年来关于H2S的荧光小分子探针备受青睐，且涌现出一系列丰硕的成果[8-10]。根据H2S的化学特性，在设计H2S荧光探针时常采取的策略有三种[11-12]：①H2S还原叠氮/硝基为氨基；②H2S的一步或两步亲核取代反应；③生成金属硫化物。见图1(封三)。下面将通过上述三种传感H2S机理的不同分别对小分子H2S荧光探针进行综述。

1 基于还原反应的H2S荧光探针

H2S具有较强的还原性，在一定条件下可与叠氮、羟胺或硝基发生还原反应而生成氨基取代物。由于反应前后的取代基有着较明显的吸电子能力差异，因而可通过选择和调节荧光团上的取代基的给电子/吸电子能力，来改变探针的电子密度(或分布)及电子迁移，进而实现所设计小分子的荧光强弱变化、发射波长的红移或蓝移等，并由此诞生了诸多基于还原反应的H2S荧光探针。

Lippert等[13]以罗丹明作为荧光团和叠氮基为反应基团制备得到了两个H2S荧光探针1与2(图2)。分子结构中闭合环状的内酯结构使得1和2本身没有荧光，而当向它们的溶液中加入H2S后，-N3被H2S选择性地还原为-NH2，同时内酯结构开环而产生明显的荧光(λem=525nm)。竞争性实验表明，ROS与RNS如H2O2、tBuOOH、ClO-、NO2-、NO、O2-、GSH、Cys、S2O3-、硫辛酸等均不影响对H2S的检测，表现出对H2S较高的选择性和灵敏性，成功实现了在HEK293T细胞和其它哺乳动物细胞中对外源性H2S的荧光检测。上述两个探针的不足在于检测限与响应时间，于是Lippert[14]对探针进行了进一步优化，得到了新的探针3～5(图2)，提高了对H2S响应的灵敏度和特异性。重要突破是利用化合物5实现了对内源性H2S的实时检测，结果表明在血管内皮细胞中，H2S的产生除依赖于胱硫醚γ-裂解酶(CSE)外，还与血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)密切相关。

图2 探针1～5的结构

Sun等[15]开发了一种以苯并吡喃为母核，-N3为反应位点的近红外双光子H2S荧光探针6(图3)。该探针对H2S表现出很高的选择性，其它RSS与ROS均对检测无影响，对H2S的检测限达3.5μM(λex=520nm，λem=670nm)，利用6成功检测了商业胎牛血清(FBS)中的H2S含量。此外，在双光子荧光显微镜辅助下，该探针还可用于对MCF-7细胞和深层组织(小鼠肝癌组织切片)中的荧光成像。更为重要的是依靠探针6，人们首次实现了小鼠活体内的H2S荧光造影。

王莹等[16]利用氨基苯基花色素染料在长波长区域的强发光特性，设计合成了一个以-N3为活性位点的H2S荧光探针7(图3)。在530nm激发波长下，此探针在600～700nm范围内能高选择性、高灵敏性地检测H2S，同时在0～60μM浓度区间内线性关系良好，灵敏度达7.65×10-8M。由于7对H2S的检测波长达到了630nm，位于红光区，具有避免生物分子自发荧光干扰和组织穿透性高的特点，该探针成功用于HeLa细胞中外源性H2S的荧光成像。

与探针7思路类似，Chen等[17]同样以花色素型阳离子衍生物为荧光团，改之亚硝基为识别位点设计合成了一个高效的“OFF-ON”型H2S荧光探针8(图3)。向8中加入H2S时，亚硝基迅速被还原为氨基而在625nm处产生强烈的荧光(λex=570nm)。在0～4μM浓度区间内，荧光强度与NaHS的浓度具有良好的线性关系，并由此可得出其对H2S的检测限为29nM。该探针也成功用于SMMC-7721细胞中H2S的荧光成像。

2 基于亲核反应的H2S荧光探针

在生理条件下，H2S的主要存在形式为HS-，其亲核性比Cl-、OH-等常见阴离子强许多。就pKa而言，H2S约为7.0，而其它代表性巯基化合物如GSH、Cys的则为7.0～8.5，表明在生理环境中H2S比GSH、Cys等具有更强的亲核性。因此，利用H2S的强亲核性，可将HS-与其它阴离子或巯基化合物区分开。该类型的荧光探针又可细分为两类：①发生一次亲核取代反应；②发生两次亲核取代反应。Li等[18]以花青素染料为荧光团，利用H2S对Cl的亲核取代反应而制备了分子9(图3)。该分子在近红外区对H2S表现出优异的比例型光声信号响应，随着H2S对Cl的取代，800nm处的光声信号逐渐衰减，而720nm处则逐渐增强。探针9成功用于小鼠体内，对H2S的光声成像具有高保真和快速清除的效果。

图3 探针6～11的结构

Li等[19]设计并合成了两个双光子H2S荧光探针10与11(图3)，它们均对H2S有很好的选择性和灵敏性，在Tris-HCl缓冲溶液中的检测响应时间快至50s。探针10的检测机理为：在H2S的介导下，10发生串联二硫化物交换，随后历经亲核取代-环化反应，最后荧光得以增强。而11的荧光团(1，8-萘二酰亚胺)由于是通过酰胺键连接，加入H2S后导致荧光呈“OFF”状态，所以无法验证其双亲核取代反应历程。进一步地，探针11成功用于对MCF-7细胞中H2S的荧光成像。探针10通过与细胞器特异性染料共定位实验，表明其能靶向溶酶体(重叠率达0.94)。

3 基于CuS生成的H2S荧光探针

以识别基团结合Cu2+后，通常由于Cu2+的顺磁性会导致荧光小分子的荧光发生淬灭。而S2-有很高的亲和力，其Ka值达10-36。向体系中加入H2S后，电离平衡产生的S2-与Cu2+迅速结合形成CuS沉淀，于是荧光分子的荧光重新恢复。

基于上述原理，Sasakura等[20]选取荧光素为荧光团，以酰胺键分别连接cyclen、cyclam及tacn，并利用Cu2+为配位金属离子制备得到了4个荧光素-大环多胺-Cu(П)配合物12～15(图4)。其中13对H2S表现出高选择性和高灵敏性，ROS与其它RNS无响应，且由于其高稳定性，高浓度的GSH也不影响H2S的检测。由于激发波长在可见光区，通过以不同浓度的H2S孵育HeLa细胞，并对比20min后细胞内平均荧光强度，发现FI20min/FI0min随Na2S孵育浓度增加而增大。除此之外，13还可广泛用于检测各种酶反应体系中的H2S，如3-巯基丙酮酸转硫酶(3MST)，或来自3MST表达细胞的溶菌液及3-巯基丙酮酸等。该探针在胱硫醚β-合成酶(CBS)、CSE与3MST等的激动剂与拮抗剂的高通量筛选领域颇具潜力，并期待在深入探索H2S的生理功能方面发挥重要应用。

Palanisamy等[21]以cyclen为Cu2+为金属中心，蒽环为荧光团，制备了一个H2S荧光探针16(图4)。当加入NaHS后，CuS沉淀的生成使荧光得以恢复。16对H2S除了优良的选择性，还有另外的优点，如较快的响应速度(小于1min)，低的检测限(205nM)及良好的可逆性等，最终该探针成功用于HeLa细胞及斑马鱼中对H2S的荧光成像。

图4 探针12～16的结构

4 总 结

作为气体信号分子之一的H2S在各项生理活动中均有其身影，虽然对它的研究在逐步深入，但同时也距离揭开其“神秘面纱”还为时尚早。H2S的重要性除了在生命科学，还将体现在医药、食品、农业和环境等各个方面。要想彻底了解H2S的产生、代谢、功能、信号调节等各个环节，必然迫切需要对它的高灵敏度和低成本的高效检测手段，因而，开发和探索针对H2S的小分子荧光探针将持续受到化学、生命科学和医学领域的研究者的青睐。本论文仅限对当前有代表性的H2S荧光探针做个小结(见表1)，随着新型荧光探针理念的发展完善和荧光检测技术的升级，对H2S生理功能的全面揭示将指日可待。

表1 本文列举的H2S荧光探针总结