阿尔茨海默病外周血中miR-219和CaMKⅡ-γ的表达

唐 恬 赵 宇

阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)是神经性退行性疾病，其临床特征为学习能力降低、认知功能障碍、记忆减退及行为异常，严重影响患者家庭和生活质量[1]。主要病理特征是突触变性、神经纤维缠结等，导致神经元丢失。在我国AD患病人群大多在60岁以上，患病率达3.46%～6.41%，且逐年增长[2]。目前关于AD疾病发病机制有很多猜测，包括脑p-淀粉样蛋白(p-Amyliod，Aβ)级联学说、神经元凋亡假说、tau蛋白过度磷酸化假说、Ca2+稳态失调假说等。最近研究[3-4]发现，microRNA(miRNA)与神经退行性疾病相关，miR-219在AD患者大脑组织中被下调，参与tau蛋白磷酸化。海马组织中，miR-219可通过影响钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ，CaMKⅡ)参与调控小鼠海马组织的记忆损伤[5]。据报道[6]，CaMKⅡ可调控蛋白磷酸化级联反应，从而调节多种基因转录，改变神经元兴奋，在学习记忆中起重要作用。然而miR-219、CaMKⅡ-γ对AD疾病的影响鲜有文章报道。本文旨在探究AD患者外周血血清miR-219和CaMKⅡ-γ mRNA表达情况，并分析其与AD疾病的相关性。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取四川大学华西医院门诊部2016年2月至2019年2月收治AD患者79例，其中男性49例，女性30例，年龄60～85岁，平均(75.41±7.68)岁。纳入标准：AD患者均符合阿尔茨海默病临床诊断标准[7]。排除标准：①有脑卒中史，有心脏、肝、肾功能和视觉障碍；②患有高血压、脑血管、糖尿病；③有抑郁症病史；④有步态不稳，癫痫病、行为异常病史。根据临床痴呆表(clinical dementia rating scale，CDR)评分[8]将AD患者分为轻度组29例，中度组24例，重度组26例。选择同期本院健康体检者79例为对照组，男性44例，女性35例，年龄55～86岁，平均(75.18±8.06)岁，AD组与对照组年龄、性别比较差异无统计学意义(P>0.05)。本研究通过本院伦理委员会批准，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》，且本研究参与者同意签署知情同意书和临床研究协议书。

1.2 主要试剂及仪器 白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)酶联免疫吸附(enzyme linked immunos-rbent assay,ELISA)试剂盒(JK-a-0023)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA试剂盒(JK-a-0016)均购自上海晶抗生物工程有限公司；RNA提取试剂盒(R1200-100)购自北京索莱宝科技有限公司；SYBR©Green Quantitative RT-qPCR Kit(QR0100)购自日本Takara公司；PrimeScript RT reagent Kit(RR047A)购自日本Takara Biotechnology；5427R本德台式高速冷冻离心机购自德国Eppendorf公司；C1000 TouchTMPCR仪、CFX96荧光定量PCR仪购自美国Bio-Rad公司；SmartSpec Plus核酸蛋白测定仪购自美国Bio-Rad公司。

1.3 研究方法

1.3.1 样本采集与保存 所有研究对象禁食12 h后，抽取外周血5 mL于EP管中，室温静置25 min后，4 ℃，3 500 r/min离心15 min，收集血清，分装，保存于-80℃备用。

1.3.2 临床痴呆评分测定 根据CDR评分[8]，测评项目包括记忆力、定向力、解析问题能力、分析问题能力、社会独立能力、家庭生活幸福指数、智力兴趣、自我生活能力等。依据评分结果分为健康(0分)、可疑痴呆(0.5分)、轻度痴呆(1分)、中度痴呆(2分)、重度痴呆(3分)。由同一位临床经验丰富的精神科资深医师测评和汇总。

1.3.3 实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)检测外周血血清miR-219、CaMKⅡ-γ的表达 利用RNA提取试剂盒提取血清总RNA，用核酸蛋白测定仪测量RNA A260/280在1.8～2.0，说明RNA质量良好。采用PrimeScript RT reagent Kit逆转录RNA，得到cDNA产物，miR-219、CaMKⅡ-γ引物及内参U6、GAPDH引物采用上海生工合成。采用qRT-PCR测定miR-219、CaMKⅡ-γ水平，利用qRT-PCR仪按照设定程序进行操作。程序设定为参数94 ℃预热1 min，94 ℃ 35 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，共35个循环。总反应体系(20.0 μL)：2×SYBR Green Taq Ready Mix 10.0 μL，上下游引物各2.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 4.0 μL。引物由上海生工合成，每例样本重复操作3次，记录Ct值，miR-219以U6为内参，CaMKⅡ-γ以GAPDH为内参，采用2-ΔΔCt算法计算miR-219、CaMKⅡ-γ相对表达量。引物序列见表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.4 酶联免疫法检测外周血血清TNF-α、IL-6的表达 采用IL-6 ELISA试剂盒、TNF-α ELISA试剂盒检测所有研究对象外周血血清IL-6和TNF-α水平，具体操作步骤参考试剂盒说明。

2 结果

2.1 AD组和对照组外周血血清CaMKⅡ-γ mRNA和miR-219水平比较 与对照组相比，AD组患者血清CaMKⅡ-γ mRNA水平较高(P<0.05)，miR-219水平较低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 AD组和对照组血清CaMKⅡ-γ和miR-219水平比较

2.2 AD组和对照组外周血血清IL-6、TNF-α水平比较 与对照组相比，AD组患者血清IL-6、TNF-α水平较高，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 AD组和对照组血清IL-6、TNF-α水平比较

2.3 不同严重程度AD患者外周血血清CaMKⅡ-γ mRNA、miR-219、IL-6、TNF-α水平比较 与轻度组相比，中度组和重度组患者血清CaMKⅡ-γ mRNA、IL-6、TNF-α水平较高(P<0.05)，血清miR-219水平较低，差异均有统计学意义(P<0.05)；与中度组相比，重度组血清CaMKⅡ-γ mRNA、IL-6、TNF-α水平较高，血清miR-219水平较低，差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表4 不同严重程度AD患者血清CaMKⅡ-γ mRNA、miR-219、IL-6、TNF-α水平比较

2.4 AD患者外周血血清miR-219水平与CaMKⅡ-γ水平相关性分析 miRTarBase网站预测，miR-219与CaMK Ⅱ存在结合位点，Pearson分析显示AD患者外周血血清miR-219水平与CaMKⅡ-γ水平存在明显相关性(r=-0.710，P<0.05)。见图1、2。

图1 miR-219与CaMK Ⅱ结合位点

图2 AD患者外周血血清miR-219水平与

2.5 AD患者外周血血清miR-219、CaMKⅡ-γ mRNA水平与IL-6、TNF-α水平相关性分析 Pearson分析显示，AD患者外周血血清miR-219与IL-6、TNF-α呈负相关(P<0.05)，Pearson分析显示CaMKⅡ-γ与IL-6、TNF-α呈正相关(P<0.05)。见表5。

表5 AD患者血清miR-219、CaMKⅡ-γ mRNA水平与IL-6、TNF-α水平相关性分析(n=79)

3 讨论

AD是导致患者认知障碍、运动障碍、记忆障碍的神经退行性疾病[9]，其主要病理特征是β-淀粉样蛋白沉积形成老年斑，细胞内tau蛋白高度磷酸化导致神经元受损及大脑皮质神经元及突触衰竭，引起脑皮质动脉血管病变[10]。有研究[11]发现，AD患者血清和脑组织中存在较强炎症反应，很可能是脑内较强的炎症反应导致神经组织受损，进而引起细胞死亡。临床上已发现淀粉样蛋白诱导AD患者血清和脑组织中血管破裂[12]。

IL-6细胞炎症因子，可促进氧化应激反应，增加脑组织损害，导致神经细胞消亡；也可以促进β-淀粉样蛋白沉积，进而影响神经元突触功能[13]。TNF-α是一种神经毒素，能间接作用于神经元发挥毒性作用。杨姗杉等[14]发现，AD血清和脑脊液中IL-6和TNF-α水平显著高于对照组，且随疾病程度加重，IL-6和TNF-α水平逐渐增加。本研究发现，AD患者血清IL-6、TNF-α水平均显著高于对照组，且不同严重程度AD患者血清IL-6、TNF-α水平随病情增加而增加，重度组患者血清IL-6、TNF-α水平显著高于中度组和轻度组，中度组患者血清IL-6、TNF-α水平显著高于轻度组，提示AD发生发展可能与IL-6、TNF-α有密切关系，IL-6、TNF-α可能直接或间接导致神经元细胞凋亡。

miR-219参与调节N-甲基-D-天冬氨酸受体信号通路[5]。CaMKⅡ是多功能蛋白激酶，由12个亚基组成，包括α、β、γ和δ 4种亚单位[15]。Ghosh等[16]发现，CaMKⅡ活性变化及tau蛋白磷酸化与AD患者神经元纤维缠结关系密切，另外细胞内Ca2+稳态失衡可进一步加剧β-淀粉样蛋白沉积，促进tau蛋白磷酸化，诱导神经元细胞凋亡，导致发生认知功能障碍，加重AD病情。Santamaria等[3]发现，阿尔茨海默氏病患者脑组织中miR-219水平下降，可能与tau蛋白磷酸化相关。余正和等[17]发现，抑郁症患者外周血白细胞中miR-219水平低于对照组，CaMKII mRNA水平高于对照组。本研究发现，与对照组相比AD血清miR-219明显降低，CaMKⅡ-γ mRNA水平明显升高，与轻度组相比，中度组和重度组患者血清CaMKⅡ-γ mRNA水平较高(P<0.05)，miR-219水平较低(P<0.05)，与中度组相比，重度组血清CaMKⅡ-γ mRNA水平上升(P<0.05)，miR-219水平降低(P<0.05)，提示血清miR-219、CaMKⅡ-γ可能参与AD发生发展。与余正和等[17]研究结果一致。Pan等[18]发现，CaMKⅡ-γ是N-甲基-D-天冬氨酸受体信号通路组成部分，miR-219通过靶向CaMKⅡ-γ进而调节N-甲基-D-天冬氨酸受体信号通路介导神经行为功能障碍。本研究发现，miR-219与CaMK Ⅱ存在结合位点，miR-219与CaMKⅡ-γ呈负相关，提示miR-219可能与CaMKⅡ-γ共同影响AD病情。本研究还发现,miR-219水平与IL-6、TNF-α水平呈负相关，CaMKⅡ-γ与IL-6、TNF-α呈正相关，提示miR-219、CaMKⅡ-γ可能通过调节IL-6、TNF-α表达影响AD病情。

综上所述，AD患者外周血血清CaMKⅡ-γ mRNA水平上调，miR-219水平下调，与病情严重程度有关，可能参与AD发生、发展。本研究由于样本数量有限，需要进一步加大样本数量，验证本研究内容。