聚六亚甲基双胍对金鱼嗜水气单胞菌的杀灭及金鱼细菌性疾病的治疗效果

冯亚明， 杨智景， 顾海龙， 王建国， 朱 峰， 朱宏庆， 戴传志

(1.江苏省农业科学院 泰州农业科学研究所，江苏 泰州 225300； 2.江苏农牧科技职业学院， 江苏 泰州 225300)

金鱼(Cyprinuscarpio)起源于中国，是世界上最早的观赏鱼养殖品种之一[1]。因其具有较高的经济价值和文化价值，受到世界各国人民的喜爱，观赏鱼的养殖规模逐渐扩大。金鱼养殖密度较大，发生疾病的机率高，不仅影响其观赏价值，还严重影响其生长发育和繁殖，造成较大的经济损失[2]。金鱼为非食用鱼类，用药没有严格限制，抗生素滥用现象普遍，病菌的耐药性发展较快，导致一些常规的疾病都难于控制。聚六亚甲基胍(Polyhexamethylene biguanide hydrochloride， PHMB)为环保型高分子聚合物杀菌消毒剂，为无色、无嗅、不燃、不爆的液体，具有杀菌谱广、有效浓度低、作用速度快、性质稳定、易溶于水的优良性能，可在常温下使用，长期抑菌，无腐蚀性[3]。其水溶液中能产生电离，亲水基部分含有强烈的正电性，吸附呈负电性的各类细菌、病毒，进入细胞膜能抑制膜内脂质体合成，造成菌体凋亡，达到最佳的杀菌效果[4]，是前景较好的抗生素替代品[5]。目前，聚六亚甲基双胍对金鱼疾病控制效果的研究报道较少，因此，于2019年在江苏省沈高镇某金鱼养殖场进行聚六亚甲基双胍盐酸盐对金鱼嗜水气单胞菌的杀灭效果、金鱼急性毒性作用及金鱼细菌性疾病的治疗效果试验，以期为金鱼疾病的控制和减少抗生素药品的使用提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

聚六亚甲基双胍盐酸盐为山东优索化工科技有限公司生产，含量为20%(浓度为200 g/L)。金鱼为江苏农牧科技职业学院饲养的草种金鱼。在水族箱中饲养2个月以上，活力旺盛，吃食正常，体重(23.15±2.38)g。试验用水为曝气72 h以上的自来水，水温(23.1±1.4)℃，pH 7.2～7.6，硬度约120 mg/L。每天虹吸出粪便、残食。

1.2病原提取及诊断

1.2.1金鱼发病情况2019年4月12日，江苏省沈高镇某金鱼养殖场的金鱼出现较严重的死亡现象，病鱼胸鳍及鳞片下皮肤出血、眼球出血，解剖后腹腔有红色血样粘稠液体，肾脏肿大出血，经初步诊断为细菌性疾病。常规用药治疗后效果不明显，显示出对多种抗生素具有耐药性。

1.2.2病原提取从养殖场采集濒死病鱼在江苏农牧科技职业学院水产科技学院实验室进行细菌病原分离，得到大量细菌培养物。按照科赫法则原理，采用江苏农牧科技职业学院饲养的健康1龄金鱼，注射细菌纯培养物，产生了相同症状，重新分离细菌菌株，纯培养后经16sRNA鉴定为嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)，确定为该病病原。

1.3试验方法

1.3.1聚六亚甲基双胍杀菌效果试验将病原菌用生理盐水稀释至7.44×104cfu/mL，将病原菌悬液200 mL置于灭菌的三角烧瓶中，添加聚六亚甲基双胍盐酸盐，使其浓度分别为0.01 mg/L、0.02 mg/L、0.03 mg/L、0.04 mg/L、0.05 mg/L、0.10 mg/L、0.20 mg/L、0.40 mg/L、0.80 mg/L、1.60 mg/L，每个浓度为1个处理，以不加药物作为对照，3次重复。药液和菌液充分混合后放入摇床轻轻震动培养2 h，然后从每组混合液中吸取0.1 mL用玻璃涂抹棒均匀涂抹在灭菌冷却的营养琼脂平板上，平板直径为90 mm。涂抹完成后放入恒温生化培养箱(普天SHP-160E)，30℃培养24 h,计数平板上的菌落数量。

1.3.2聚六亚甲基双胍对金鱼的毒性试验依照预试验结果设置5个浓度试验组，分别为0.3 mg/L、0.6 mg/L、0.9 mg/L、1.2 mg/L、1.5 mg/L和1个空白对照组，3次重复。每组随机放入活力旺盛的草金鱼10尾，记录24 h、48 h、72 h、96 h的死亡数，死亡个体即刻移出。死亡判定标准为玻璃棒多次触及无任何反应即判定为死亡。试验期间持续充气，隔24 h更换药液1次，试验期间不投食。

1.3.3聚六亚甲基双胍临床使用效果根据实验室得出的最低有效浓度和金鱼的半致死浓度设定治疗浓度，均匀泼洒到生病的池塘。池塘规格为3 m×3 m×0.4 m，实际水量3 t，治疗期间24 h开启增氧机，增氧方式为涡旋鼓风机(森森，HG-3000)柱状气泡石增氧，每池4个气泡石，试验期间用溶氧仪(YSI-550A)检测溶氧量均在5 mg/L以上。水色浓绿色，透明度(23±4)cm，检测总菌量平均值为3.62×104cfu/mL。选择病严重的水泥池10个，每池约有1万尾金鱼，每天死亡500～600尾鱼。按照毒性试验和杀菌试验的结果设置治疗浓度为0.05 mg/L、0.1 mg/L、0.2 mg/L、0.4 mg/L，设1个空白对照组，每平行2个池，用药后每天计数死亡量，并采集池水测定总菌量。

1.4数据分析

所有数据用Excel 2010整理后求平均值，数值以平均值±标准差表示。利用Trimmed Spearman-Karber法[6]求24 h、48 h、72 h和96 h的半致死浓度值(LC50)；安全浓度(SC)的计算参照文献[7]中的方法(SC=96 h 的LC50值×0.1)。用SPSS 19.0进行比较分析，ANOVA和Duncan多重比较进行各组之间平均值的差异显著性检验。

2结果与分析

2.1聚六亚甲基双胍盐酸盐的杀菌效果

从图1看出，当聚六亚甲基双胍盐酸盐浓度为0.01 mg/L时，细菌菌落数量显著下降，菌落数量为对照的27.15%；浓度为0.01～0.03 mg/L时菌落数量差异不显著；浓度为0.04 mg/L时菌落数显著下降，菌落数量为对照的9.40%；浓度在0.05～0.40 mg/L时，菌落数量显著变少，仅为对照的1%，但各浓度处理间菌落数量差异不显著。浓度高于0.4 mg/L时菌落数为0。表明，聚六亚甲基双胍盐酸盐浓度为0.01 mg/L对嗜水气单胞菌具有较好的预防效果，当浓度达0.05 mg/L时具有较好的治疗效果。

2.2聚六亚甲基双胍盐酸盐对金鱼的毒性

经观测，金鱼进入0.9 mg/L以上浓度的聚六亚甲基双胍盐酸盐溶液中时表现躁动，四处乱撞，呼吸频率明显加快，鱼体表粘液增多，水中出现大量絮状物质；中毒鱼游泳无力，呼吸频率变慢，脱黏，体色发白；濒临死亡的鱼完全失去平衡，呼吸极度虚弱，鳃丝发白。从图2看出，浓度为1.5 mg/L、1.2 mg/L的处理金鱼24 h内完全死亡，其中，1.5 mg/L处理10 h开始出现死亡，18 h全部死亡；0.9 mg/L处理24 h时金鱼成活率80%，72 h时仅20%，96 h时全部死亡；0.6 mg/L处理48 h时金鱼存活率100%，72 h时为80%，96 h时为40%；0.3 mg/L处理96 h时金鱼成活率仍然为100%。从表1看出，24 h的LC50为0.97 mg/L，48 h的LC50为0.90 mg/L，72 h的LC50为0.71 mg/L，96 h的LC50为0.59 mg/L，安全浓度为0.06 mg/L。

表1 聚六亚甲基双胍盐酸盐对金鱼的急性毒性值及其95%置信区间

2.3聚六亚甲基双胍临床使用效果

2.3.1不同处理的细菌总量从图3看出，对照3 d内细菌总量逐渐增加，差异不显著。聚六亚甲基双胍浓度为0.05 mg/L、0.1 mg/L和0.2 mg/L处理24 h内水体细菌总量均显著减少，细菌总量分别为起始浓度的6.15%、1.15%和0.7%。48～72 h各处理的细菌总量为起始浓度的0.5%～2.7%，差异不显著，说明细菌数量得到有效控制。

2.3.2不同处理金鱼的死亡数从表2看出，使用浓度在0.05～0.10 mg/L处理24 h死鱼数量显著减少(P<0.05)，0.20 mg/L处理死鱼数量略多于对照组，但差异不显著(P>0.05)，0.40 mg/L处理死鱼数量显著高于对照组(P<0.05)，但和0.20 mg/L处理差异不显著(P>0.05)。48 h用药处理死鱼数量均显著少于对照(P<0.05)，其中，0.20 mg/L以上浓度的处理显著小于0.10 mg/L以下浓度的处理(P<0.05)。72 h用药处理显著少于对照(P<0.05)，各浓度处理间差异不显著(P>0.05)。96 h时0.20 mg/L以上浓度组没有死鱼，0.1 mg/L以下浓度组有少量死鱼，但4个治疗处理死鱼数没有显著差异(P<0.05)。试验期间总死鱼量用药处理均显著低于对照(P<0.05)，0.20 mg/L以上浓度处理显著高于0.10 mg/L以下浓度处理，说明药物浓度≥0.2 mg/L可能对生病金鱼具有刺激性，会加速病鱼死亡。

表2 不同浓度聚六亚甲基双胍盐酸盐处理生病金鱼不同时间的死亡鱼数

3结论与讨论

3.1聚六亚甲基胍对细菌的杀灭效果

聚六亚甲基胍是一种新型环保型杀菌剂，广泛应用于餐具、医疗器械、粘膜系统的消毒[3]。聚六亚甲基双胍盐酸盐杀灭细菌作用快，在2 h内能让细菌失活死亡(待报道)。秦志华等[8]报道，0.5 mg/L浓度的聚六亚甲基双胍对海水副溶血弧菌和鳗弧菌具有较好的杀灭效果，3 h内杀菌率达97.6%，比1 mg/L的二氯异氰尿酸(22.5%)高75.1%，且效果更加持久稳定。研究表明，聚六亚甲基胍浓度为0.05 mg/L对嗜水气单胞菌杀菌率高达99%，实际在水泥池治疗使用中杀菌率为93.85%，略低于实验室杀菌率，但明显降低了细菌总量，有效控制了疾病。刘志轩等[9]比较了ClO2-、PHMG、H2O2及PVPI 对4种弧菌副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrioharveyi)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)及Vibriosp.Ex25的杀灭作用，发现PHMB杀菌率随时间的推移逐渐升高，0.125 mg/L的PHMG可使养殖水体中的弧菌总量在第4天降到最低值，到第11天时弧菌总量仍然维持在消毒前初始值的3.58%，有效杀菌浓度与本研究相似。谷桂英等[10]发现，4 mg/L的PHMB在1 h内能完全杀死大黄鱼致病弧菌。现有研究表明，PHMB和其他几种消毒剂相比具有高效、持久等优点，在水产养殖中将会有良好的应用前景。

3.2聚六亚甲基胍对金鱼的毒性

王群等[11]研究发现，聚六亚甲基双胍对凡纳滨对虾幼虾24 h和48 h的LC50为64.1 mg/L和31.13 mg/L，安全浓度为2.20 mg/L；对成虾24 h和48 h的LC50分别为66.17 mg/L和32.16 mg/L，安全浓度为2.28 mg/L，0.5 mg/L浓度以内对无节幼体的变态率无明显影响，建议用量控制在0.5 mg/L内。对球等鞭金藻和亚心形扁藻的生长不产生抑制的最高浓度为5 mg/L，安全浓度分别3.5 mg/L和2.9 mg/L。研究发现，金鱼对聚六亚甲基双胍比较敏感，24 h、48 h、72 h、96 h的LC50分别为0.97 mg/L、0.90 mg/L 0.71 mg/L及0.59 mg/L，远低于凡纳滨对虾，浓度较高时金鱼很容易发生死亡。苏筱竺[12]研究了PHMB对双齿围沙蚕(Perinereisaibuhitensis)24 h、48 h、72h的LC50分别为0.059 mg/L、0.057 mg/L、0.052 mg/L，安全浓度为0.016 mg/L，虽然能短时间内降低双齿围沙蚕体内微生物的比例，但因为对其太敏感不适宜作为细菌病治疗药物。曹鑫磊[13]在22℃下试验了苯扎溴铵络合碘对平均体质量6.3 g的金鱼96 h为0.878 mg/L。SHUN等[14]研究了三氯异氰尿酸，戊二醛，高锰酸钾对金鱼48 h的LC50为4.1 mg/L、8.8 mg/L、5.9 mg/L。PHMB和苯扎溴铵络合碘相比，对金鱼的毒性相似，和三氯异氰尿酸，戊二醛，高锰酸钾相比，毒性要大于这些常规消毒药物。根据研究的毒性试验结果，建议在金鱼上的使用安全浓度为0.06 mg/L。

3.3聚六亚甲基胍在防治鱼类细菌性疾病的应用价值

金鱼场发生疾病时常使用过三氯异氰尿酸和聚维酮碘消毒治疗，但在安全浓度范围用药时，水体中的细菌总量降下去后很快反弹，疾病没有得到有效控制。使用PHMB后水体总菌量迅速下降，疾病逐渐得到控制。在中国对虾[8]、凡纳滨对虾[9]、大鳞鲆[15]等海水鱼虾弧菌引起的疾病防控中发现，PHMB具有消毒效果快，药效持久等特点，和当前常用的消毒相比其对多种病原的消毒效果好[16]。谷娜等[17]为了治理水体中铜绿微囊藻污染物,用聚六亚甲基双胍(PHMB)-磁性蒙脱土去除水体铜绿微囊藻发现，1 mg/L的 PHMB和14 mg/L的磁性蒙脱土共同作用时，水体中铜绿微囊藻叶绿素a去除率及浊度的去除率分别达96%和85%，具有明显的净化水质作用，所以PHMB是一种非常具有潜力的细菌病防治新药。

毒性试验结果表明，PHMB对不同类型动物毒性差别较大，对虾蟹毒性相对较小，而对鱼类、沙蚕类动物毒性较大。在使用PHMB治疗金鱼嗜水气单胞菌引起的疾病过程中也发现，当浓度0.20 mg/L时对鱼体产生一定的刺激性，加速了病鱼的死亡，使3 d内的总死鱼量显著高于0.10 mg/L以下浓度。所以PHMB在用于防治虾蟹类细菌疾病时是相对较安全的药物，但用于鱼类细菌性疾病时，还需做大量的毒性试验研究，慎重使用，以防发生药害。