基因多态性与不明原因习惯性流产的相关性分析

宿喜萍 唐晓琳 陈金莲 陈多珍

【摘要】目的：探讨MTHFR基因多态性与不明原因习惯性流产间的相关性。方法：本次纳入对象为我院妇产科2018年11月～2019年4月收治的不明原因习惯性流产患者30例，选取同期于我院妇产科住院的正常妊娠女性30例设为健康组，检测两组MTHFR基因多态性，主要使用技术为聚合酶链反应-限制性片段长度多态性技术（PCR-RFLP）。结果：URPL组TT基因型频率为26.7%，比健康组10.0%更高;CC基因型频率为20.0%，比健康组40.0%更低，比较有统计学差异（P<0.05）;两组CT基因型频率为53.3% vs 50.0%，比较无统计学差异（P>0.05）。结论：MTHFR基因多态性密切关联于URPL，T等位基因可能为遗传易感因素之一。

【关键词】MTHFR基因多态性;不明原因习惯性流产;相关性

[中图分类号]R714.21   [文献标识码]A   [文章编号]2096-5249（2020）15-000-02

习惯性流产即女性自然流产次数≥2次（或3次）者，其中孕周在12周以内流产者占70%左右，被国际上称作复发性自然流产，发生率为2%～5%左右[1]。有多种因素会导致自然流产，如感染、遗传缺陷、子宫畸形、个人行为与环境、内分泌或激素分泌异常、血栓形成倾向及自身免疫疾病等。习惯性流产夫妇开展各种检查后仍无法明确流产病因者被称作原因不明习惯性流产（URPL），占比为50%～75%[2]。当前国内外均报道了亚甲基四氢叶酸还原酶（MTHFR）多态性与URPL的关系。MTHFR作为关键酶主要经同型半胱氨酸（Hcy）和叶酸代谢，其功能在于不可逆还原5，10-亚甲基四氢叶酸至5-甲基四氢叶酸，密切关联于DNA合成与甲基化。当前已经明确MTHFR基因多态性中C677T会降低MTHFR活性，阻碍Hcy向甲硫氨酸转变，诱发高同型半胱氨酸血症并降低叶酸水平，导致妊娠期胎盘形成血栓风险增加，导致胚胎停育、胎盘栓塞等，最终诱发习惯性流产。现选取URPL患者与正常妊娠女性各30例，探讨MTHFR基因多态性与URPL的关联。

1 资料与方法

1.1一般资料 本次纳入对象为我院妇产科2018年11月～2019年4月收治的URPL患者30例，早期妊娠习惯性流产史≥3次，夫妇双方外周血染色体核型均无异常，均无家族遗传病史;经子宫输卵管造影、妇科及B超等检查明确无生殖器解剖畸形;内分泌功能无异常，B超对排卵情况予以监测无异常，月经周期无异常，基础体温为双相，排除内分泌病史如甲状腺功能亢进及糖尿病史者;弓形虫病原或巨细胞病毒检查结果为阴性者;抗磷脂抗体及抗核可抽提抗原抗体检查连续超过3次，每次间隔超过4周结果均为阴性;规律生活，无药物滥用、抽烟及酗酒史。30例患者年龄为22～37岁，平均年龄为（28.6±4.7）岁;妊娠时间为32～100d，平均妊娠时间为（53.7±6.4）d;选取同期于我院妇产科住院的正常妊娠女性30例设为健康组，年龄为21～36岁，平均年龄为（27.4±3.6）岁;妊娠时间为34～104d，平均妊娠时间为（55.8±7.2）d。两组对象一般资料比较无统计学差异（P>0.05），具有可比性。

1.2一般方法 采集两组空腹状态下肘静脉血，行抗凝处理，使用0.2%EDTA，将血细胞DNA提取出来。先使用低渗溶血法将白细胞分离出来，氯、酚法将人基因组DNA提取出来。使用（PCR-RFLP）技术检测两组MTHFR基因多态性，合成扩增的引物序列如下：P1： 5'-CAAAGGCCACCCCGAAGG-3'，反义为5'-AG-GACGGTCCGGTGAGAGTG-3'。25μl为PCR反应体系总体积，10×Buffer，引物为0.3μmol/LMG2+，模板DNA为0.1μg，dNTPs为200μmol/L，aq酶为1UT，0.25μmol/LMG2+;5min、94℃为预变性参数，1min、94℃为变性参数，1min、57℃为复性参数，1min、72℃为延伸参数，循环35次后再次设定7min、72℃为延伸参数。对PCR产物予以观察，使用2%琼脂糖凝胶电泳，将10μlPCR产物取出，添加2μl10×Buffer與10UHinf I酶，补水后使产物达到20μl，持续消化16h并控制温度为37℃，结果使用2.5%琼脂糖胶电泳观察。

1.3统计学方法 对本组获取的数据开展统计学处理，应用SPSS21.0软件，计数资料表示方法为n（%），卡方检验χ2开展组间对比，若P<0.05提示比较有统计学差异。

2 结果

两组MTHFR基因型频率比较246bp为扩增PCR结果片段长度，使用HinFI酶切消化该产物，会形成MTHFR基因型，共3种，包括杂合子型CT、纯合突变型TT及野生型CC，246bp中包含C等位基因者HinfI不可消化，而含T等位基因者则被消化为72BP与174BP。两组MTHFR基因型频率、等位基因频率比较如表1所示。

3 讨论

URPL有复杂的发生机制，当前各种相应治疗方案均无确切疗效，妇产科一直将其作为疑难问题。人类基因组计划全部完成，现代医学开始思考人类疾病发生发展可能关联于基因，故而可浅显地认为人类所有疾病均属于基因型。近年来临床对URPL免疫遗传学病因的研究报道逐渐增加且成为关注热点，并从传统遗传模式角度向探索易感基因与易感染色体角度转变。

MTHFR基因主要在染色体1P36.3处定位，外显子共11个，5-甲基四氢叶酸为活化叶酸，转化甲基为半胱氨酸后将蛋氨酸生成，进而对蛋氨酸-半胱氨酸代谢予以调节。MTHFR酶依赖叶酸，存在遗传突变性，当前发现的主要突变位点为MTHFR677C→T，其多态会将酶热不稳定性增加。本组选取的患者均排除其他会导致习惯性流产的因素，发现TT基因型频率为26.7%，比健康组10.0%更高，说明TT型基因可能为独立预测因素。综合而言，MTHFR基因突变诱发URPL的机制可能如下：MTHFR基因密切关联于5-甲基四氢叶酸，而该因子属于甲基供体在机体核酸、嘧啶及嘌呤等因子代谢中均有所参与。因胎盘中缺少MTHFR活力，致使机体蛋白质与DNA甲基化缺少，此为胚胎发育必要因子，故而导致流产、胚胎停育，同时还会将半胱氨酸浓度增加，损伤血管内皮细胞并产生毒性，将血小板聚集与黏附增强，诱发胎盘血管栓塞性病变，这是重复性URPL与神经管缺陷的主要危险因素[3]。另一方面，MTHFR基因突变降低酶的活力，影响机体营养、遗传等因素。高半胱氨酸血症为主要遗传因素之一，作为已知的风险因子会导致白种人形成动静脉血栓。MTHFR677C→T为常见的遗传缺陷，该突变导致酶蛋白中丙氨酸被络氨酸取代，并使MTHFR形成46℃不耐热的变异，诱发高半胱氨酸血症后导致胎盘栓塞诱发流产[4]。此外，半胱氨酸会毒性作用于胚胎，在神经胚胎形成期其损害致畸作用突出。另有研究表明[5]胎儿MTHFR基因突变也会增加自然流产风险，说明习惯性流产可能关联于母胎双方基因型异同，若均为纯合677T等位基因型则有更高的自然流产发生率。临床已经证实叶酸的摄取量为MTHFR基因突变主要营养因素，因此妊娠妇女一定要对叶酸予以适当补充，还可选择维生素B12及B6，实用且经济。

综上所述，MTHFR基因多态性密切关联于URPL，T等位基因可能为遗传易感因素之一。

参考文献

[1] 黄山鹰， 唐国玲， 刘庆芝， 等. MTHFR的基因多态性与原因不明复发性流产的相关性分析[J]. 国际生殖健康/计划生育杂志， 2017， 36（5）： 382-384.

[2] 李乾， 常亮， 刘平， 等. 母胎亚甲基四氢叶酸还原酶基因C677T多态性与不明原因习惯性流产发生风险的相关性研究[J]. 生殖医学杂志， 2018， 27（10）： 981-985.

[3] 郭谦楠， 冯战启， 康冰， 等. 河南汉族父亲MTHFR基因对母亲不明原因反复自然流产的影响[J]. 重庆医学， 2016， 45（13）： 1736-1739.

[4] 肖海， 娄桂予， 张倩， 等. 不明原因复发性自然流产患者HVEM基因多态性检测研究[J]. 重庆医学， 2019， 48（16）： 2808-2810.

[5] 郭春燕， 艾红梅. 雌激素受体β基因多态性和不明原因复发性流产的关系探讨[J]. 实用妇产科杂志， 2018， 34（4）： 272-276.