海南霉素钠预混剂在鸡体内的药动学及生物利用度研究

王美红，郭桂芳，聂贞，张小龙，蒋玥，顾梦恬*，卜仕金*

(1. 扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009； 2. 中国兽医药品监察所，北京 100081； 3. 江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州 225009)

海南霉素是从稠李链霉菌东方变种的代谢产物中提取出来的聚醚类抗生素[1]，主要用于鸡球虫病的防治，其市售产品为1%海南霉素钠预混剂，经农业部核准的推荐治疗剂量为7.5 ppm。据报道，海南霉素钠预混剂对鸡球虫病防治效果良好[2-3]，同时还具有促增重和提高饲料利用率的作用[4]。然而聚醚类药物的毒性较大、安全范围较窄，此类药物使用不合理会导致鸡中毒和兽药残留，威胁人类健康[5]。尽管海南霉素已经上市十多年，国内外关于海南霉素的报道主要是关于其疗效、毒性和对动物生长性能影响等方面的研究，而关于其检测分析的发表论文仅有四篇[6-9]，其中Wang等[9]利用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)检测了饲料中海南霉素的含量。常用聚醚类抗球虫药药动学的报道已见于莫能菌素[10-11]，其中Henri等[10]研究了莫能菌素在鸡体内的药代动力学。有关海南霉素在动物组织和血浆中含量的检测方法以及在鸡体内药代动力学和生物利用度方面的研究未见报道。目前在对动物源性产品的几种主要的聚醚类抗生素含量的检测中,液质联用技术使用广泛且高效[12]，采用HPLC-MS/MS检测方法已见相关报道[13-15]。有鉴于此，建立一种测定鸡血浆中海南霉素含量的HPLC-MS/MS检测方法，并开展海南霉素钠预混剂在鸡体内的药动学和生物利用度研究，不仅对指导临床合理用药、预测药物在鸡体内的消除动态、蓄积特性和残留消除规律等具有一定的参考价值，同时对丰富和完善国产一类新兽药的临床药理学资料具有重要现实意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药品与试剂 海南霉素对照品(纯度>99.87%)、1%海南霉素钠预混剂(批号HNP11702006)，均由山东胜利生物工程有限公司惠赠；甲醇、乙腈为色谱级，购自美国TEDIA公司；甲酸为色谱级，购自东京化成工业株式会社；乙酸铵为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备 AB SCIEX 三重四级5500系统，含串联(TQ)四级杆Mass检测器和Analyst软件；Waters 2695 HPLC 高效液相色谱仪；Ultimate XB-C18色谱柱(1.8 μm, 2.1×100 mm)；Pacific RO 纯水仪，北京五洲东方科技发展有限公司；超生波清洗器，德国Elma Elmasonic P 专业级；氮吹仪，美国Organomation公司；Genius23010、ABN2ZA氮气发生器，英国Peak Scientific公司；Eppendorf 5810R高速冷冻离心机，上海肯强仪器有限公司；SI可调速漩涡混合器，上海思伯明仪器设备有限公司；可调微量移液器。

1.1.3 溶液的配制

1.1.3.1 流动相 将乙腈和0.1%甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵)按90 ∶10(V/V)的比例混匀，经0.22 μm滤膜过滤，并通过超声脱气处理,现配现用。

1.1.3.2 海南霉素标准液和工作液的配制 海南霉素标准储备液：准确称量约10 mg海南霉素标准品置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，制备浓度为1 mg/mL海南霉素标准储备液。

海南霉素工作液：准确吸取适量的海南霉素标准储备液，用甲醇稀释成浓度为1 μg/mL海南霉素工作液，混匀，现配现用。

1.1.3.3 海南霉素钠注射液 准确称取一定量的海南霉素钠对照品加入适量甲醇溶解后，用灭菌注射用水稀释成1%溶液，供静脉注射用。现配现用。

1.1.4 试验动物 3月龄的健康AA鸡16只，平均体重约3 kg，由江苏八达畜禽有限公司提供。受试鸡采用翅标标识。试验前受试动物至少2周内未使用过相关药物，并经过至少1周适应期。试验期间受试动物按常规条件饲养，自由饮水和采食，饲料为不添加任何药物的全价饲料。

1.2 方法

1.2.1 动物分组、给药及血样采集 16只体重相近的健康AA鸡随机分成2组，每组各8只，在给药前一天采集空白血液。第1组1～8号鸡单剂量经口灌服1.5 mg/kg bw的海南霉素钠预混剂受试品，第2组9～16号鸡单剂量静脉注射1.5 mg/kg bw的海南霉素钠注射液。给药后分别于10 min、15 min、20 min、30 min、45 min、1 h、1.5 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、16 h、24 h各采集血样一次，每次采血量约2～4 mL 左右。血样采集后置于经肝素浸润并60 ℃烘干的10 mL离心管内，混匀后离心，分离血浆后于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.2.2 血浆中海南霉素含量的测定 血浆样品中海南霉素的含量采用经验证的 HPLC-MS/MS 法测定。准确吸取0.5 mL新鲜或冻融的血浆样品于10 mL离心管中，加入2 mL甲醇-乙腈(50∶50，V/V)，涡旋振荡2 min，超声10 min，10000 r/min离心10 min。上清液移至10 mL刻度离心管中，40 ℃氮吹至干。残渣用1 mL甲醇溶解，涡旋振荡2 min，10000 r/min离心5 min，上清液经0.22 μm有机滤膜过滤，滤液转移至高效液相色谱系统的自动进样瓶中供HPLC分析测定。

色谱条件为：色谱柱Ultimate XB-C18(1.8 μm，2.1×100 mm)；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液(90∶10,V/V)；流速0.4 mL/min；柱温30 ℃；进样量5 μL。质谱条件为：电喷雾离子源正离子扫描模式(ESI+)；质谱多反应监测(MRM)模式；串联(TQ)四级杆Mass检测器；喷雾电压5500.0 V；气帘气压力20.0 psi；碰撞室压力8 psi。离子化(离子源)温度：450.0℃。根据海南霉素一级质谱扫描和二级质谱扫描，确定定量离子为845.6m/z,定性离子为863.6m/z,碰撞能量均为32 eV,去簇电压为50.0 V。

准确度和精密度通过空白血样添加海南霉素质控样品的回收率和平行血样添加海南霉素质控样品的变异系数进行评价。

1.2.3 给药后血浆样品中海南霉素含量的测定 将各时间点采集的血浆样品分别按1.2.2项血浆样品处理方法处理后，采用HPLC-MS/MS检测方法进行测定，获得海南霉素的峰面积，并用随行标准曲线回归方程计算出各时间点血浆样品中海南霉素的含量。

1.2.4 数据分析 分别将各个动物的实测血浆药物浓度-时间数据，采用Winnonlin5.2药动学分析软件拟合药动学参数，并计算出各组动物平均药代动力学参数，进行统计学分析比较。生物利用度的计算按以下公式：

式中F：生物利用度；AUCpo：口服药时曲线下面积；AUCiv：静注药时曲线下面积；Div：静注给药剂量；Dpo：口服给药剂量。

2 结果与分析

2.1 鸡血浆中海南霉素含量测定的HPLC-MS/MS方法学验证 如图1～图3所示，在本实验建立的HPLC-MS/MS条件下,海南霉素的出峰时间约为5.58 min,待测组分能与溶剂峰以及血浆中其他基质组分完全分开。海南霉素在1～500 ng/mL范围内线性关系良好(R2≥0.999)，检测限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.5 ng/mL和1 ng/mL；海南霉素在低、中及高浓度下相对回收率在94%～101%之间；批间变异系数与各批内变异系数均小于10%。

图1 海南霉素标准液(10 ng·mL-1)总离子流图Fig 1 Total ion flow diagram of Hainanmycin (10 ng·mL-1) in standard sample

图2 空白血浆总离子流色谱图Fig 2 Total ion flow diagram of chicken blank plasma

图3 空白血浆中添加海南霉素(10 ng·mL-1)总离子流色谱图Fig 3 Total ion flow diagram of Hainanmycin(10 ng·mL-1)in blank plasma

2.2 药动学参数 按1.5 mg/kg bw单剂量经静脉注射和口服给药后的平均血药浓度-时间曲线分别见图4和图5，药动学参数结果见表1。由表1知，静脉注射给药后海南霉素的平均消除半衰期(T1/2β)和平均滞留时间(MRT)分别约为46.31 h和3.31 h，平均血浆清除率(CL)约为0.58 L/(kg·h)，平均表观分布容积(Vd)约为35.52 L/kg；口服给药后海南霉素的平均消除半衰期(T1/2β)约为30.21 h，平均滞留时间(MRT)约为8.78 h，在血浆中的达峰时间(Tmax)约为0.5 h，达峰浓度(Cmax)约为68.87 ng/mL，平均药时曲线下面积(AUC)约为318.93 ng·h/mL,平均生物利用度(F)约为 32.82%。

图4 单剂量静注海南霉素钠注射液后的平均药时曲线图Fig 4 Average plasma concentration-time curve after single dose intravenous injection premix

图5 单剂量口服海南霉素钠预混剂后的平均药时曲线图Fig 5 Average plasma concentration-time curve after single dose oral administration of Hainanmycin sodium premix

表1 单剂量静注海南霉素钠注射液和口服 海南霉素钠预混剂后的药动学参数Tab 1 Pharmacokinetic parameters of single dose intravenous injection and oral administration of Hainanmycin sodium premix

3 讨论与结论

3.1 鸡单剂量静注海南霉素钠注射液后的药动学特征 在Henri等[10]关于莫能菌素在鸡体内的药动学和残留研究中，静注组(0.46 mg/kg bw)的平均消除半衰期(T1/2β)约为11.26 h，平均滞留时间(MRT)约为10 h，平均血浆清除率(CL)约为1.77 L/(kg·h)，平均表观分布容积(Vd)约为14.05 L/kg，该药物在鸡体内分布较为局限、消除较快，给药6 h后在除脂肪外的其他基质中均无法检测到残留。而在本研究中，鸡单剂量静注(1.5 mg/kg bw)海南霉素钠注射液后，海南霉素的平均消除半衰期(T1/2β)约为46.40 h，平均滞留时间(MRT)约为30.91 h，平均血浆清除率(CL)约为1.59 L/(kg·h)，平均表观分布容积(Vd)约为116.05 L/kg，表明海南霉素在鸡体内分布广泛、消除缓慢，其容易在鸡体内蓄积。

3.2 鸡单剂量口服海南霉素钠预混剂后的药动学特征 鸡单剂量口服(1.5 mg/kg bw)海南霉素预混剂后，达峰时间(Tmax)和达峰浓度(Cmax)分别约为0.5 h和68.87 ng/mL，表明鸡口服海南霉素钠预混剂后吸收较迅速；海南霉素的平均消除半衰期(T1/2β)约为30.44 h，平均滞留时间(MRT)约为36.40 h，消除速度相对较慢；平均药时曲线下面积(AUC)约为654.95 ng·h/mL，生物利用度(F)约为32.82%，表明海南霉素口服给药吸收不完全，进入鸡体内的海南霉素量较低。类似的研究结果见于Henri等[10]关于莫能菌素药动学研究报道中，莫能菌素口服(4 mg/kg bw)在鸡体内的生物利用度(F)约为30%，使用非线性混合效应模型评估时生物利用度(F)约为11.36%，但Henri等[10]亦表明使用非线性混合效应模型评估时的药动学变量似乎不准确。由于海南霉素是在肠道中发挥抗球虫的作用，且海南霉素毒性较大，较低生物利用度不仅有益于其抗球虫作用，而且对减少其毒副作用也是有利的。鉴于海南霉素在鸡体内消除缓慢，因此，在生产实践中，要严格控制剂量和用药时间，以免长期或大剂量连续用药产生的蓄积毒性。