多糖与抗菌肽的结合及相关应用研究进展

彭星桥，詹晓北

江南大学 生物工程学院，江苏 无锡 214122

抗生素滥用造成了多重耐药菌在全球范围内出现，比如多重耐药金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等，这些多重耐药菌对免疫力低下的人群来说非常危险[1]。由于缺乏有效对抗这些多重耐药菌的药物，多重耐药菌感染的临床病例正在逐年增加[2]。因此，寻求新的能代替传统抗生素的抗菌剂已迫在眉睫。

抗菌肽是一类具有抗菌作用的多肽分子总称，通常由12～100个氨基酸残基构成[3]。天然抗菌肽是组成微生物、植物和动物天然免疫系统的主要组成部分[4]，合成抗菌肽是基于天然抗菌肽的结构加以改性设计所得的新型抗菌肽[5]。抗菌肽普遍具有抗菌谱广、抗菌效果强的特点，主要攻击微生物细胞膜和细胞壁，微生物对抗菌肽不易产生抗性而形成耐药菌，且抗菌肽易被分解[3]，其分解产物对环境无影响，不会长时间存在土壤和水体中，被认为是最有希望替代传统抗生素的新型抗菌剂[6]。

抗菌肽在实际应用中由于自身特性受到很多限制，有些抗菌肽的抗菌稳定性不好，容易失效，比如乳酸链球菌素(nisin)[7]；有些抗菌肽抗菌时效不够，不能起到长效抑菌作用，比如聚赖氨酸(ε-polylysine)[8]；有些抗菌肽毒性太大，比如蛙毒肽(magainin)和蜂毒肽(melittin)等[9]，这些抗菌肽都不能直接作为药物或食品添加剂使用。将大分子和抗菌肽进行有机结合后，大分子能对抗菌肽提供一定保护作用，并限制其过快扩散，是有效增强抗菌肽稳定性，降低其毒性的一种方法[10]。

多糖是一大类天然生物大分子，其来源广泛，性质多样，一般由十个到上万个单糖分子经各种糖苷键连接而成[11]。在结构上和生物合成上，多糖比蛋白质和脂质更复杂，所以多糖的研究明显滞后于蛋白质和脂质，随着近年来各种检测技术的不断升级，多糖研究也在不断深入[12]。大部分多糖都具有良好生物安全性和生物相容性，且结构单元相对蛋白和脂质更简单，容易对其定向改性，是小分子活性物质的良性载体和结合物质，而小分子活性物质和多糖的相互作用以及结合物的特性也慢慢成为了一个研究热点[6]。作者着重介绍多糖和抗菌肽结合的研究成果和相关应用的开发进展，希望能为后续相关研究工作提供一定的参考和借鉴。

1 多糖与抗菌肽的结合方式

不同多糖在结构和性质上差异很大，不同抗菌肽有不同生理活性，对于应用来说，应该根据相应需求选择合适多糖和抗菌肽。在目前的研究中，多糖主要用以帮助抗菌肽解决抗菌性能不稳定、时效不长、毒性过大和功能单一等问题[13]，相应结合物的应用见图1。

图1 抗菌肽的各项缺陷、结合多糖的目的以及相关结合物的应用

多糖与抗菌肽结合的研究主要集中在近5年，多糖与抗菌肽的结合方式主要有共混、离子共聚、接枝3种[14]，下文将就这3种结合方式以及相应研究进展进行详述(图2)。

图2 几种典型多糖及其与抗菌肽的常见结合方式

2 多糖与抗菌肽的共混

大部分多糖都能形成稳定的水溶液或水凝胶体系，将抗菌肽与多糖水溶液或水凝胶进行共混是最简单的实现多糖和抗菌肽结合的方式[10]。在这种结合方式下，抗菌肽和多糖分子之间没有离子或共价的结合，多糖形成的稳定结构给予包覆于其中的抗菌肽一定保护作用，而随着多糖负载体系在应用环境中的解离，负载于其中的抗菌肽会被以一定速率释放出来[15]。通过这种方式得到的混有抗菌肽的水凝胶既可以直接作为溶液或水凝胶使用，也可以在不同分散体系中形成纳米颗粒或在一定条件下干燥成膜后再进行使用[16]。根据负载体系的最终形态，多糖与抗菌肽的共混体系可分为水凝胶负载体系、纳米颗粒负载体系、纤维负载体系及膜负载体系(图3)。

图3 抗菌肽负载于大分子水凝胶体系中的示意图

2.1 水凝胶负载体系

多糖水凝胶是由多糖分子自体或有成型剂存在下形成的三维交联网络结构，能有效吸收和保持大量水分，能保持稳定形状且又有一定流动性，可作为传统合成高分子水凝胶的有效替代，目前已广泛应用于食品、化妆品、药品等领域中[16]。抗菌肽这类小分子活性物质在简单搅拌条件下就能均匀分散于水凝胶体系中，且水凝胶体系可以对活性小分子提供一定支撑力，防止小分子过快沉降，保持整个体系较长时间的均匀性[15]。

Lu等[17]将肉桂素和乳酸链球菌素复合在海藻酸钠水凝胶中，涂布在北方黑鱼片的表面，不会影响鱼片风味和口感，还能保持其颜色鲜艳，杀灭附着于表面的细菌，延长其保质期。Ugurlu等[18]将乳酸链球菌素与果胶-HPMC水凝胶相混合，压制成片，这种片剂能保持乳酸链球菌素通过消化道到达结肠发挥抗菌作用。Cao等[19]将乳酸链球菌素和大蒜素均匀混入壳聚糖凝胶中，涂布在新鲜猪大排表面，发现涂布了该凝胶的猪大排保质期明显延长。Malheiros等[20]用细菌纤维素凝胶来固定清酒乳杆菌产生的抗菌肽，发现这种固定化抗菌肽的抗菌性能比游离状态更好。Silva等[21]将合成抗菌肽LLKKK18负载于透明质酸钠自组装形成的纳米凝胶后，抗菌肽稳定性提升，降解速率降低，在体外试验中，该负载有LLKKK18的纳米凝胶能进入巨噬细胞胞内，杀死其中感染巨噬细胞的结核分枝杆菌，并减少巨噬细胞中白介素-6和TNF-α这类炎症因子的分泌。Diosa等[22]将抗菌肽KR-12与壳聚糖凝胶共混后，在pH 6环境中固定在多孔二氧化硅中制成抗菌材料，这样处理后材料的疏水性能增加，抗菌性能提升，可作为抗菌植入体使用。

2.2 微颗粒负载体系

多糖水凝胶可以通过多种方法制备成不同粒径微颗粒，得到的这种微颗粒往往有特殊界面性能，常常被用来作为精准药物递送、组织工程等应用的主要组成部分[23]。单一多糖水凝胶就能在一定条件下形成稳定的微颗粒体系，只要将活性小分子和多糖水凝胶预先混合均匀，在多糖水凝胶形成微颗粒时，就能将活性小分子包覆在其中。微颗粒的表层结构比较稳定，所以相比于水凝胶来说，微颗粒能给包裹于其中的活性小分子提供更多保护[1]。

Luo等[24]将大豆多糖制成粒径为112 nm的纳米颗粒，并成功将乳酸链球菌素包覆在形成的纳米颗粒中，形成的颗粒对单核细胞增多性李斯特氏菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌均具有良好抑制作用，且该纳米颗粒负载体系能实现乳酸链球菌素的有效控释，达到长效抗菌效果。Wu等[25]将乳酸链球菌素包埋于壳聚糖微颗粒中，喷涂在小黄鱼表面，能有效保持小黄鱼风味，延长保质期。Novickij等[26]将乳酸链球菌素负载于果胶形成纳米颗粒，这种颗粒配合静电脉冲，能在比较宽的pH值范围内有效杀灭食品表面99.9%的革兰氏阳性菌，可作为新型食品防腐剂。Krivorotova等[27]和Gruskiene等[28]也证实乳酸链球菌素可有效负载于果胶形成的纳米颗粒中，这种负载体系能有效延长乳酸链球菌素的抗菌时效性。Hosseini等[1]则将乳酸链球菌素与海藻酸钠共混，制备了负载有乳酸链球菌素的海藻酸钠微球和海藻酸钠-抗性淀粉微球，并发现乳酸链球菌素在海藻酸钠-抗性淀粉微球中的释放率比在单纯海藻酸钠微球中小，但这两种微球都具有良好抗革兰氏阳性菌活性。Lopes等[29]将乳酸链球菌素包覆在脂质体、果胶和聚半乳糖醛酸的微颗粒中，经比较发现，果胶微颗粒对单核细胞增多性李斯特氏菌的抑制作用是这3种微颗粒中最强的。Divsalar等[30]将乳酸链球菌素和壳聚糖-氧化锌水凝胶进行共混制成微颗粒，再复合进纤维素膜中，得到的复合膜有很强的抑菌性能、优越的力学性能，用作包装材料可以保证奶酪在14 d内不变质。Gui等[9]将蜂毒肽包埋在葡萄糖硫酸酯控释修饰毒素的纳米颗粒中，负载效率约为30%，得到的颗粒没有显著细胞毒性，抗菌性能可维持8 d。

多种多糖复合物体系也可以形成微颗粒，其中最典型的是壳聚糖-阴离子多糖体系。壳聚糖是一种典型阳离子多糖，而海藻糖是一种典型阴离子多糖，两者能在水溶液中通过离子聚合形成稳定共聚物，控制这种反应的反应条件，能得到不同粒径的壳聚糖和海藻酸钠微颗粒，在微颗粒形成过程中，会将溶液中存在的活性分子包裹在封闭颗粒内部，从而实现对活性物质的有效负载[31]。Coppi等[32]将多黏菌素B负载在这种壳聚糖-海藻酸钠微颗粒中，形成的微颗粒粒径为1 μm左右，这种微颗粒能进入Caco-2胞内，这些微颗粒对细胞没有显著毒性，但仍具有良好抗菌性能，可以作为口服抗菌药物。Liu等[33]也使用这种壳聚糖-海藻酸钠微颗粒系统来对ε-聚赖氨酸进行了有效负载，这种方式得到的微颗粒对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和藤黄微球菌都有良好抑制作用。Zimet等[34]用这体系将乳酸链球菌素负载于微颗粒中，发现形成的微颗粒对几种典型革兰氏阳性菌均有良好抑制性，并且这种抑制性能维持21 d。壳聚糖还可以和聚谷氨酸形成稳定的离子共聚物，而这种离子共聚物也可以形成微颗粒，Sun等[35]先将人源抗菌肽LL-37和聚谷氨酸通过离子聚合进行结合后，将结合物加入壳聚糖溶液中，结合物中的聚谷氨酸和壳聚糖进一步反应形成微颗粒，成功制备了负载有LL-37的壳聚糖-聚谷氨酸微颗粒，其中LL-37能在pH7.4条件下实现缓慢释放。Cui等[36]将乳酸链球菌素负载于壳聚糖-聚谷氨酸微粒中，乳酸链球菌素能从该微粒中缓慢释放出来，所以该微粒能在较长时间内保持抑菌效果，可用于奶酪的抗菌包装材料中。

2.3 膜负载体系

部分多糖的成膜性非常好，在食品保鲜膜、医用敷料等领域中有着广泛应用，而在这些多糖膜中负载有抗菌活性的小分子是现在多糖膜的主要研究方向之一[7]。

部分抗菌肽疏水性太强，在亲水性多糖水凝胶中分散性并不是很好，在将其和水凝胶进行混合时需要进行一定优化。Pattanayaiying 等[39]优化了混合条件，将乳酸链球菌素和百里香酚在EDTA的作用下均匀分散于普鲁兰胶形成的膜中；Hassan等[40]也将乳酸链球菌素、百里香酚和月桂氨基乙酯和普鲁兰胶进行混合，干燥成膜后与聚乙烯膜进行复合，得到的复合膜能有效杀灭肉类食品中绝大多数的食源性腐败菌，是一种理想的肉类食品包装材料。Bagde等[41]从乳酸片球菌和屎肠球菌培养液中提取出了两亲性抗菌肽，并将这两种抗菌肽加入了含有纳米纤维素的淀粉膜中，得到的淀粉膜抗菌效果能持续28 d。González等[42]用烷基烯酮二聚体修饰了TEMPO氧化处理过的细菌纤维素纳米管，使其可以用来固定化特定发酵液中存在的抗菌肽。

3 多糖与抗菌肽的离子共聚

除了壳聚糖外，几乎所有天然多糖都是带负电的阴离子多糖，而绝大多数抗菌肽在酸性和中性条件下都带正电，所以阴离子多糖和阳离子抗菌肽很容易因电荷吸引发生离子共聚，而共聚产物基本根据形态分为共聚水凝胶和共聚颗粒。

3.1 共聚水凝胶

Chang等[8]发现，ε-聚赖氨酸会和阿拉伯胶在水溶液中形成稳定的、透明的静电共聚水凝胶，这种水凝胶对拜耳接合酵母和酿酒酵母这两种典型的食源性腐败菌均有良好抑制作用，可以作为防腐剂用于果汁饮料中。Zhang等[43]将ε-聚赖氨酸和阿拉伯胶形成的共聚水凝胶通过聚多巴胺作为连接体连接到钛合金表面，这样的钛合金材料有良好抗菌性，且能有效防止生物被膜形成，可以作为有抗菌性的骨植入体使用。

3.2 共聚颗粒

Gong等[44]发现乳酸链球菌素和阿拉伯胶能在水溶液体系中快速聚合，并在一定条件下形成共聚颗粒，这种共聚颗粒在121 ℃热处理后仍保持良好抗菌活性，且其抗菌时效性比游离的乳酸链球菌素长24 h，说明阿拉伯胶和乳酸链球菌素在该条件下的结合较为紧密，这种结合能有效提高乳酸链球菌素的抗菌稳定性。Silva等[5]则将合成抗菌肽LLKKK18与糊精进行共聚，形成共聚物颗粒，混合入卡波姆凝胶中，得到的凝胶能有效抑制巨噬细胞的炎症反应，并能够加速伤口愈合，是一种有良好应用前景的伤口敷料。

4 多糖与抗菌肽的接枝

将抗菌肽以共价结合方式与多糖进行接枝，可以进一步提高多糖对抗菌肽稳定性的提升，但也由于发生了不可逆共价结合，接枝产物的抗菌性能和其他生物活性可能会发生一定变化[45]。

4.1 通过酰胺化反应接枝

许多多糖的结构组成单元中都有一个或多个糖醛酸，这些糖醛酸上的羧基比较容易和抗菌肽中游离氨基发生酰胺化反应，从而实现多糖和抗菌肽的接枝[47]。Peng等[48]发现，乳酸链球菌素中的游离氨基和结冷胶中葡萄糖醛酸上的羧基能在EDC/NHSS催化下进行酰胺化反应，得到乳酸链球菌素和结冷胶的接枝物，反应机理如图4所示，得到的接枝物能在酸性、中性和碱性环境中保持较长时间抗菌性，在经过热处理和蛋白酶处理后，该接枝物仍能保留部分抗菌性能，且对细胞没有显著毒性，是一种很有潜力的抗菌药物。Peng等[49]还尝试将多黏菌素B和结冷胶进行接枝，发现这两种分子在EDC/NHSS催化下就能进行酰胺化反应，生成接枝物微团，该接枝物微团不仅有良好抗菌性能，还能抑制内毒素引发的神经细胞炎症作用，可用于预防革兰氏阴性菌感染引起的伤口神经性炎症。

图4 结冷胶和乳酸链球菌素在EDC/NHSS催化下进行酰胺反应的示意图

Severino等[50]将多黏菌素B和海藻酸钠在水溶液中进行混合，发现多黏菌素B也能和海藻酸钠在水溶液中就发生酰胺化反应，将这种反应物固定于固态磷脂纳米颗粒中，可以有效降低多黏菌素细胞毒性，达到缓释的效果。Li等[51]则证明了聚赖氨酸能和卡拉胶进行酰胺化反应，由于这种新型接枝物的产生，添加了聚赖氨酸的卡拉胶溶液流动能会随着聚赖氨酸的添加量增加而降低。

有些抗菌肽和阴离子多糖的反应不需要催化剂或其他分子做辅助，所得接枝物可以直接用作植入或解除人体表皮的医药材料[52]。Lin等[53]发现，新型抗菌肽Tet213能与海藻酸钠、透明质酸钠和胶原蛋白均发生接枝反应，将Tet213加入这3种水凝胶的混合物中可以得到一种全新混合水凝胶，该水凝胶溶胀率高，有一定孔径，抗菌性能良好，可以加速伤口愈合，是一种很有前景的伤口敷料。Toppazzini等[13]将人源抗菌肽LL-37和海藻酸钠进行了共混，发现两者在水溶液中就能进行反应生成相应接枝物，该接枝物不仅没有LL-37的细胞毒性，还保留有LL-37的抗菌性，是一种新型抗菌生物材料。Cassin等[54]将LL-37和透明质酸钠以及胶原蛋白分别进行共混使其接枝，得到的接枝产物制备成胶原蛋白-透明质酸钠复合膜，这种膜没有显著细胞毒性，且能防止大肠杆菌的黏附和生长，是一种理想的植入体表面覆层材料。

4.2 通过谷氨酰胺转移酶或“Click”反应接枝

对于主链上有氨基存在的多糖来说，可以通过转氨反应或者“Click”反应实现其与抗菌肽的接枝。Zhu等[55]提出，可以利用谷氨酰胺转移酶将壳聚糖和乳酸链球菌素结合在一起，接枝率可以通过控制反应时间来调价，得到的接枝产物水溶性比壳聚糖和乳酸链球菌素都要好，其对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌质量浓度低至0.008 mg/mL，并且这种接枝物没有显著细胞毒性。

Barbosa等[56]研究发现，多种抗菌肽都可以通过“Click”反应与壳聚糖进行接枝，且这种接枝对其抗菌性的影响有限。Yang等[57]通过“Click”反应将抗菌肽KR12固定于淀粉基大孔海绵材料中，得到的海绵材料不仅能迅速止血，还能发挥一定抗菌作用，是贯穿伤口紧急护理的理想材料。

4.3 通过美拉德反应接枝

对于结构单元中没有活性羧基，也没有活性氨基的多糖来说，可以通过席夫碱反应或美拉德反应实现其与抗菌肽的接枝。Wu等[58]将乳酸链球菌素和纤维素通过美拉德反应进行了接枝，得到的接枝产物对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有良好抑制效果，且成膜性也非常好，可以用在抗菌食品包装材料中。

Li等[59]发现ε-聚赖氨酸和葡聚糖可以在亚临界水中进行美拉德反应，得到的产物在110 ℃条件下还能保持抗菌性。Muppalla等[60]成功在辐射条件下将nisin通过美拉德反应和葡聚糖进行了接枝，得到的产物对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌都有良好抑制性，有效拓宽了nisin的抑菌谱，而且该接枝产物还被证实有显著抗氧化活性。

5 结论与展望

综上所述，多糖和抗菌肽结合，不仅能提高抗菌肽稳定性，增加其抗菌时效，还能降低某些抗菌肽的细胞毒性，增加某些生理活性，且多糖和抗菌肽的结合相对比较简单，不需要烦琐反应步骤，反应过程可控性较高，有良好应用前景。

目前，多糖和抗菌肽结合的研究还只是集中在几种已经商品化的多糖和抗菌肽上，不同多糖和不同抗菌肽的结合机制以及相应产物的结构特性研究已有了初步成效，对这两者结合产物的抗菌性能研究也已经比较深入，有的产物已经在食品和伤口敷料中有了一些应用型研究。但是这方面研究很少涉及还未规模化生产的多糖和抗菌肽，某些多糖，尤其是传统中草药来源多糖，有着非常独特的生理活性，探究这些新型多糖与抗菌肽的相互作用，将为进一步利用多糖和抗菌肽奠定坚实理论基础。