姜黄素对变异链球菌产酸、耐酸能力的影响

李京洋，姚毅章，赵国廷

龋病是影响人类口腔健康的最常见疾病之一，是在以细菌为主的多种因素影响下，牙体硬组织发生慢性破坏性疾病。变异链球菌(Streptococcusmutans,S.mutans)是目前世界公认的主要致龋菌，其通过粘附、产酸、耐酸等作用导致牙体硬组织脱矿与再矿化的失衡，从而形成龋齿[1-3]。

姜黄素(curcumin)是一种天然的食用色素，被世界卫生组织和美国食品药品管理局以及多个国家准许作为食品添加剂使用，是从姜科姜黄属植物姜黄干燥根茎中提取的有效成分，常见的提取方法包括有机溶剂结晶法、活性碳层析法、硅胶柱层析法、活性碳层析法、乙酸沉淀法、有机溶剂结晶法等。由于姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗菌等多种生理特性作用，其在临床领域的研究受到越来越广泛的重视[4-6]。

已有学者研究姜黄素对口腔致龋菌变异链球菌致龋毒力因素的影响，张碧楚等[7]研究发现姜黄素能在不影响浮游细菌生长的情况下有效抑制变异链球菌生物膜的形成，且其抑制程度随着浓度的增加而增加；在细菌生物膜形成的复杂过程中，第一步首先是细菌粘附于物体的表面，Song等研究发现姜黄素能够有效抑制变异链球菌的粘附能力，包括牙齿表面、胶原蛋白和纤连蛋白胞外基质表面[8]；而本课题主要研究姜黄素对变异链球菌另一重要毒力因子和致龋因素——产酸耐酸能力的影响，为临床防龋研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

变异链球菌ATCC25175购买于广东省微生物菌种保存中心，牛心脑浸液培养基(Brain heart infusion，BHI，Difco，美国)；姜黄素(Sigma，美国)；Trizol总RNA试剂提取盒、逆转录试剂盒、荧光实时定量PCR试剂盒(大连宝生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 菌液制备及测定细菌的最低抑菌浓度MIC值 将冻干保存的变异链球菌ATCC25175于37 ℃厌氧培养(90%氮气，5%二氧化碳，5%氢气)、复苏、涂片、染色，显微镜下观察确定变异链球菌纯细菌，挑取单个菌落接种至BHI液体培养基中，将菌液稀释至1×108CFU/mL。配制姜黄素标准品，制备成400 mmol/L的原液，按1∶1 000的比例稀释姜黄素母液于BHI液体培养基中，采用标准微量肉汤稀释法在96孔板连续二倍稀释，姜黄素的最终浓度为25、50、100、200、400 μmol/L，于37 ℃厌氧条件下培养24 h。使用肉眼观察，孔澄清所对应的最低药物浓度为姜黄素的MIC值。

1.2.2 产酸实验 将过夜培养的含不同浓度姜黄素的变异链球菌菌液离心，姜黄素的浓度分别为1/2 MIC、1/4 MIC、1/8 MIC和0(不加姜黄素的对照组)，弃上清液，漂洗，调整D600 nm为0.5左右，重悬于50 mmol/L KCl，1 mmol/L MgCl2溶液中，KOH调整pH为7.2，加入葡萄糖，使其终浓度为1%，每隔10 min检测其pH值，连续检测60 min[9]。实验重复3次，计算平均值。

1.2.3 耐酸实验 将过夜培养的含与上述相同的姜黄素浓度的变异链球菌菌液离心，弃上清液，漂洗，调整D600 nm=0.3左右，重悬于甘氨酸(0.1 mol/L，pH=3.0)溶液中，37 ℃放置60 min后梯度稀释，涂板，培养24 h后进行菌落计数，计算存活率[10]。实验重复3次，计算平均值。

1.2.4 总RNA的提取 将过夜培养的含与上述相同的姜黄素浓度的变异链球菌菌液4 ℃离心，收集细菌沉淀，用无菌PBS缓冲液冲洗3次后，加入1 mL Trizol 试剂，反复吹打混匀，加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡，室温放置10 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。用移液枪将上层转移到新的1.5 mL EP管中，加入等体积异丙醇，混匀，4 ℃、12 000 r/min离心10 min。弃去上清液，用1 mL 75%的乙醇(用DEPC水配制)洗涤RNA沉淀，10 000 r/min、4 ℃、离心5 min。弃去乙醇，干燥RNA沉淀，加入DEPC水20 μL，用Nanodrop检测其浓度，于-80 ℃保存。

1.2.5 逆转录RNA 取各实验组RNA各1 μg，65 ℃煮5 min后立即冰上冷却。使用逆转录试剂盒进行逆转录，10 μL反应体系如下：5×PrimeScript buffer (5倍缓冲液)2 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix(逆转录酶)0.5 μL，Oligo dT Primer(寡核苷酸)0.5 μL，Random 6 mers (6核苷酸随机引物)0.5 μL，RNA 1 μg，Nuclease free H2O(不含RNase)的水至10 μL。反应条件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，将cDNA稀释10倍，于-80 ℃保存备用。

1.2.6 实时定量荧光PCR(Real time PCR)检测ldh基因表达 总反应体系为20 μL：2×SYBR Green Real time PCR 10 μL，正反向引物(10 μmol/L)0.5 μL× 2，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL，罗氏荧光定量PCR仪上进行扩增反应，反应条件为预变性95 ℃、60 s；扩增40个循环，循环参数为变性95 ℃、15 s，退火58 ℃、15 s，延伸72 ℃、45 s。引物序列：ldhF 5′-ACTTCACTTGATACTGCTCGTT-3′；ldhR 5′-ACACCAGCTACATTGGCATGA-3′；内参基因16SrRNAF 5′-AGCGTTGTCCGGATTTATTG-3′；16SrRNAR 5′-CTACGCATTTCACCGCTACA-3′[11]。每个样品均设置3附孔，实验重复3次。分析测定目的基因乳酸脱氢酶编码基因ldh及内参16SrRNA的Ct 值，实验结果取其平均值。基因表达水平用倍数变化来表示(2-ΔΔCt法)。

1.3 统计学分析

SPSS 17.0统计软件进行数据分析，数据用均值±标准差表示，实验数据用单因素方差分析进行检验，检验水准α=0.05，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 最低抑菌浓度MIC的测定结果

肉眼观察96孔板中不同浓度姜黄素对变异链球菌的影响，结果表明姜黄素浓度大于100 μmol/L的菌液无明显生长，其孔澄清，而阳性对照混浊，见图1，因此，姜黄素对变异链球菌的最低抑菌浓度MIC为100 μmol/L。

图1 姜黄素对变异链球菌MIC值

2.2 产酸实验的测定结果

姜黄素影响变异链球菌产酸的实验结果见图2，从图中看出，在最初10 min，pH值明显降低，此时在1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC浓度下变异链球菌的pH值从起始的7.2降低为5.14±0.09，5.2±0.12和5.36±0.13，但均高于对照组的5.01±0.13；之后随着时间的增长，细菌的pH值逐渐趋于平稳，60 min后，在亚抑菌浓度(1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC)下，变异链球菌最终的pH值分别为4.52±0.12，4.58±0.12和4.66±0.02，仍然都高于对照组的4.41±0.13，其中细菌在1/2 MIC浓度下的pH与对照组的差异具有统计学意义(P<0.05)。表明姜黄素对变异链球菌产酸有抑制作用，且抑制作用随着姜黄素浓度的增加而增加。

图2 姜黄素对变异链球菌产酸能力的作用

2.3 耐酸实验的测定结果

姜黄素影响变异链球菌耐酸的实验结果见图3，从图中看出，加入姜黄素明显降低变异链球菌在酸性环境中的存活率，且随着姜黄素浓度的增加，细菌的存活率随之降低，当姜黄素浓度为1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC时，细菌的存活率分别为(12.5±0.9)%，(10.8±1.1)%和(5.6±0.4)%，均明显低于对照组的(23.4±1.6)%。加不同浓度姜黄素实验组与不加姜黄素的对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明姜黄素对变异链球菌耐酸有抑制作用，且抑制作用随着姜黄素浓度的增加而增加。

*：P<0.05

2.4 ldh基因表达的定量检测结果

姜黄素对变异链球菌乳酸脱氢酶LDH编码基因ldh表达的影响见图4，从图中看出，加入姜黄素使得变异链球菌ldh基因的表达下调，且随着姜黄素浓度的增加(1/8 MIC、1/4 MIC、1/2 MIC)，ldh基因的表达随之降低，分别为0.73±0.06，0.56±0.04和0.38±0.01。加不同浓度姜黄素实验组与不加姜黄素的对照组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。表明姜黄素能抑制变异链球菌ldh基因表达，且抑制作用随着姜黄素浓度的增加而增加。

*：P<0.05

3 讨 论

龋病是以细菌为主，由多种因素如环境、宿主、时间等共同作用所导致的慢性感染性疾病，其发病率高，分布广，是口腔主要的常见病，被世界卫生组织WHO列为危害人类健康的三大重点疾病之一。变异链球菌在龋病的发生发展过程中起着非常重要的作用，变异链球菌是目前公认的主要致龋菌，能够利用日常摄入的碳水化合物代谢产酸致使牙体硬组织脱矿，从而导致龋齿形成[12-13]。变异链球菌是产酸耐酸菌，能在外源性糖充足的条件下产生乳酸，当牙面微环境的pH值降低到釉质和牙本质脱矿的临界值以下时，会导致龋病的发生；变异链球菌也能在亚致死性酸环境中生长，并通过引起自身基因表达的变化提高在致死酸性环境中的生存能力[14-16]。因此抑制致龋菌变异链球菌产酸耐酸是有效防止致龋菌感染的方法，随着研究深入，发现传统使用氟化物防龋的方法存在着一定缺陷，例如慢性氟中毒危害人体健康、口腔中耐氟菌株的产生等等；最近研究发现天然产物具有资源丰富、分布广泛、毒副作用小等诸多优势成为最新的研究热点，为未来的防龋途径提供了新思路。

本实验主要研究姜黄素对变异链球菌产酸、耐酸及相关基因ldh表达的作用，首先确定姜黄素对变异链球菌的最低抑菌浓度MIC值，随后研究发现其在不影响浮游细菌生长的前提条件下，能够有效抑制变异链球菌的产酸和耐酸能力，且随着姜黄素的浓度增加，抑制细菌的产酸和耐酸能力也随之增加；乳酸脱氢酶LDH是葡萄糖的厌氧主要代谢途径Embden-Meyerhof途径的终结酶，催化丙酮酸转化为乳酸，是合成乳酸的关键酶[17-18]，实时荧光定量PCR结果发现姜黄素抑制乳酸脱氢酶LDH编码基因ldh的表达，这一点与Xu等在研究表没食子儿茶素没食子酸酯对变异链球菌产酸毒力时发现的结果相同[19]。Hillman通过重组DNA技术构建ldh基因敲除株，发现该基因敲除株在动物体内的致龋能力明显低于野生株[20]。因此我们推测姜黄素可能通过有效抑制LDH的活性，从而降低细菌的产酸能力。我们这些研究结果表明姜黄素能有效抑制变异链球菌的产酸和耐酸能力，为临床龋病预防提供实验依据。