1,25(OH)2D3对高糖诱导的人肾小球系膜细胞株增殖能力、周期分布影响及其机制

王丽媛，唐小铁，戚婷，于洋，崔学彬，徐洁

1武汉科技大学医学院，武汉 430000；2武汉科技大学附属普仁医院

文献[1]报道，我国慢性肾脏病(CKD)患病率较高，肾小球滤过率<60 mL/(min·1.73 m2)的人群中糖尿病(DM)患者占19.1%，蛋白尿人群中DM患者占17.3%[2]，DM已经成为CKD的首要病因。糖尿病肾病(DN)作为DM最常见的微血管并发症之一，患病人数占DM总数的20%～40%[3]。研究[4]表明，DN、系膜增生性肾小球肾炎等多种CKD均能导致系膜细胞(Mc)过度增殖、系膜外基质大量沉积、肾脏正常生理结构破坏，最终发展为肾小球硬化(GS)、肾功能衰竭。当前DM患者基数巨大，DN发病率高，然而对于DN的治疗方式单一，以控制血糖血脂血压等高危因素、避免肾毒性食物药物、延缓肾功能恶化为主，尚缺乏特异性治疗药物。肾小球系膜细胞是肾小球最主要的固有细胞之一，对维护肾小球毛细血管床结构完整性、维持系膜基质代谢平衡、保护肾脏正常免疫功能有重要的作用。肾小球系膜细胞的过度增殖可导致肾脏系膜区增生、系膜外基质异常积蓄，这几乎是所有CKD存在的病理特性，同样也是DN发病的中心环节。因此，设法调控肾小球系膜细胞的增殖活性，有助于改善肾脏病理损伤、延缓DN的发生及演变[5]。1,25二羟基维生素D3[1,25(OH)2D3]是最具生物活性的维生素D，不仅具有调节钙磷代谢作用，还具有调节机体免疫、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡、诱导细胞分化等多种生物学效应[6]。2017年12月～2018年6月，我们观察了1,25(OH)2D3对高糖诱导的人肾小球系膜细胞株增殖能力、周期分布影响，并探讨其可能机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株及主要试剂 人肾小球系膜细胞株(上海拜力生物人肾小球系膜细胞供应商)。磷酸盐缓冲液(PBS)，低糖DMEM粉剂，无支原体胎牛血清，0.25%胰蛋白酶，碘化丙啶，1,25(OH)2D3，D-葡萄糖,甘露醇，LY294002，CCK-8试剂盒，兔抗人mTOR单克隆抗体，小鼠抗人p-mTOR单克隆抗体，山羊抗小鼠二抗，兔抗人Akt单克隆抗体，山羊抗兔二抗，兔抗人p-Akt单克隆抗体。

1.2 人肾小球系膜细胞培养 复苏后的人肾小球系膜细胞接种于盛有低糖DMEM完全培养液的无菌培养瓶中，细胞在瓶内呈贴壁生长。将培养瓶置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度环境下，当细胞生长至70%～80%融合时放弃原有培养液，先用PBS工作液轻柔地洗涤2次，再添加0.25%胰蛋白酶消化传代，之后将培养瓶放置在37 ℃、5%CO2、饱和湿度环境下继续培养，取第3～8代用于实验。向生长良好的对数期人肾小球系膜细胞中添加0.25%的胰蛋白酶进行消化处理。处理完成后统计数目并接种于培养板中，待观察到细胞全部贴壁后，放弃原有培养基，加入无血清DMEM进行同步化处理24 h。

1.3 1,25(OH)2D3干预后人肾小球系膜细胞增殖抑制率测算 采用CCK-8试剂盒。取生长良好的对数期人肾小球系膜细胞，以1×104个/mL接种于96孔板内，200 μL/孔，培养至细胞贴壁后，用无血清DMEM同步化24 h。按照实验设计将细胞分为6组，干预组加入30 mmol/L的D-葡萄糖和10-8mol/L的1,25(OH)2D3，1,25(OH)2D3组加入10-8mol/L的1,25(OH)2D3[7]，高糖组加入30 mmol/L的D-葡萄糖[8]，高渗组加入25 mmol/L的甘露醇，LY294002组加入2 μg/mL的LY294002，正常对照组未加任何刺激物，各组继续培养48 h。各组结束干预前4 h每孔分别加入10 μL的CCK-8溶液，继续培养4 h，用酶标仪测定各孔在450 nm波长处的吸光度值(A450)，以上实验重复3次，每次均设置无细胞组作为空白调零组，实验结束后计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=(A对照组-A实验组)/A对照组×100%。

1.4 1,25(OH)2D3干预后人肾小球系膜细胞周期分布观察 采用流式细胞术。取生长良好的对数期人肾小球系膜细胞，以2×105个/mL接种于6孔板内，2 mL/孔，培养至细胞贴壁后，无血清DMEM同步化24 h，实验分组及干预同“1.3”，各组继续培养48 h，48 h后收集细胞，用预先冻存的70%冰乙醇重悬细胞，吹打混匀，-20 ℃固定过夜。过夜后离心去除乙醇，PBS洗涤一遍，再用PBS重悬细胞，加入RNAseA(终浓度10 μg/ μL)及碘化丙啶染液(终浓度50 μg/ mL)，37 ℃避光保存40 min，上机检测。以上实验重复3次，每次试验每个实验组均设置4个复孔。测得数据按以下公式计算系膜细胞增殖指数，系膜细胞增殖指数=S期和G2/M期细胞比例之和/(G1期、S期和G2/M期细胞比例之和)。

1.5 1,25(OH)2D3干预后人肾小球系膜细胞Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白检测 实验分组及干预同“1.3”将各组细胞裂解后，高速离心25 min，后取上清，按BCA试剂盒说明书进行配平，加入合适比例的Loading Buffer后煮沸8 min使蛋白质变性，依次经过上样电泳，PVDF转模，5%奶粉封闭，PVDF置于一抗孵育，TBST洗涤6×5 min，二抗室温孵育2 h，滴加ECL发光试剂，X线片曝光，冲洗和扫描后，采用Gelpro软件比较各组条带的相对灰度值即可表示蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞A450及增殖抑制率比较 细胞A450及增殖抑制率见表1。

表1 各组细胞A450及增殖抑制率比较

2.2 各组细胞G1期、S期、G2/M期个数及Mc细胞增殖指数比较 各组细胞G1期、S期、G2/M期个数及Mc细胞增殖指数比较见表2。

表2 各组G1期、S期、G2/M期占比及Mc细胞增殖指数比较

2.3 各组细胞Ap-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量比值比较 各组细胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR蛋白相对表达量比值比较见表3。

表3 各组细胞p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比较

3 讨论

肾小球系膜细胞是肾小球最主要的固有细胞之一，对于肾脏的正常生理活动具有重要意义。研究[9]证实，肾小球系膜细胞的增殖及层黏蛋白、Ⅳ型胶原在系膜基质的集聚是DN的病理性特征。体外细胞实验发现，暴露于高糖环境中会使肾小球系膜细胞加速增殖，并大量分泌各种细胞因子、胶原蛋白及其他细胞外基质。动物实验发现，STZ诱导构建的DN小鼠模型尿白蛋白排泄水平较正常组明显升高，而且模型组小鼠肾脏病检提示肾脏的系膜区扩大、纤连蛋白表达增多[10]。临床观察也证实，5～7年病程的DM患者行肾脏病检即能发现肾小球Mc增殖和肾小球肥大[11]。大量研究均证实，高糖可促进人肾小球系膜细胞的增殖，刺激多种促生长、促增殖的细胞内信号因子产生增多，诱导氧化应激反应，导致系膜细胞的过度增殖、系膜外基质的病理集聚，最终使肾小球正常结构被破坏，致肾功能衰竭。因此采取干预措施抑制高糖对肾小球系膜的促增殖作用，对于保护肾脏功能，延缓DN的进展具有至关重要的作用。

1,25(OH)2D3是生物活性最强的维生素D，通过遍布全身各处的VitD受体施展生物效应。除了被大众熟知的调节钙磷代谢的作用外，目前1,25(OH)2D3在免疫调节、细胞增殖分化、抗肿瘤、抗衰老等众多领域也被广泛应用。1,25(OH)2D3可通过Runx2的过表达促进成骨细胞向脂肪细胞的转分化[12]；通过下调Toll样受体4介导的炎症通路减轻DM大鼠肝脏损伤[13]；通过PI3K/Akt/mTOR通路对神经起保护作用[14]。一项为期3年纳入530例T2DM患者的前瞻性研究结果提示，合并VitD缺乏的T2DM患者DN发生率明显高于VitD含量正常的T2DM患者，且这一结果相对独立，不受高血压、高脂血症、吸烟、ACEI/ARB类药物使用史等外围因素的干扰。范乐平等[15]发现，T2DM人群体内血清活性VitD含量随尿蛋白程度的上升而下降，与血肌酐、尿素氮等反映肾功能的指标呈负相关。多项研究已经证实，VitD缺乏是DN的独立危险因素，其在从DM、到DN、ESRD的疾病演变过程中发挥重要作用，因此足量的1,25(OH)2D3具有肾脏保护效应。动物实验发现，1,25(OH)2D3作用于5/6肾切除动物模型，可抑制肾小球细胞增生，延缓GS[16]；作用于DN大鼠模型，可降低尿白蛋白排泄，抑制肾小球系膜增殖[17]。胡婧等[18]发现，给予骨化三醇治疗组尿蛋白排泄率、24 h尿蛋白量、血肌酐、白介素-6水平均低于安慰剂组，提示骨化三醇有助于DN患者减轻蛋白尿、缓解炎性反应状态。本研究显示，1,25(OH)2D3能够有效对抗高糖介导的肾小球系膜细胞增殖。

文献[19]报道，PI3K/Akt/mTOR通路是蛋白质合成的主要信号调节通路。各种生长因子、胰岛素受体及外界刺激等作用可使PI3K激活，活化的PI3K生成PIP3进一步激活AKT，PIP3含有与AKT相同的PH结构域，两者相互识别并结合，将AKT由胞浆转位至胞膜，同时使AKT的构象发生变化，进而AKT被磷酸化，活化的AKT直接激活mTORC1或通过TSC1/2复合物进一步激活其下游分子MtorC1，从而实现对细胞增殖的调控[20]。Rane等[21]发现，PI3K/Akt/mTOR通路参与了高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡。邢玲玲等[22]认为，高糖可能通过激活该通路诱导足细胞分泌Ⅳ型胶原。实验证实，高糖可活化PI3K、诱导mTOR上调，促进系膜细胞的肥大增殖[23]。本文结果显示，给予高糖处理后p-Akt、p-mTOR的表达明显增多，系膜细胞增殖加速。临床研究[24～26]表明，利拉鲁肽可上调PI3K/Akt通路改善高糖诱导的内皮细胞凋亡，番茄红素能通过PI3K/Akt通路改善高糖诱导的足细胞损伤，非洛贝特、乌索酸通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路活化而抑制高糖诱导的系膜细胞增殖，雷帕霉素可明显抑制高糖诱导的系膜细胞增殖。本研究显示，与高糖组比较，1,25(OH)2D3干预组p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR相对表达量比值降低，表明1,25(OH)2D3对抗高糖介导的系膜细胞增殖的作用可能与下调PI3K/Akt/mTOR信号通路相关。

总之，1,25(OH)2D3可抑制高糖诱导的人肾小球系膜细胞的增殖活化，并将细胞阻滞于G1/S期，作用机制可能与其可下调PI3K/Akt/mTOR通路的表达有关。