miR-32-5p和FKBP14基因转染对SPC-A1细胞增殖、迁移、侵袭的影响及其靶向关系验证

杨丹芬，谢圆媛，姜棚菲，白娟，林芳

延安大学附属医院，陕西延安 716000

肺癌是常见的恶性肿瘤之一，有较高的发病率和病死率[1]。肺癌根据组织学特性分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌，其中NSCLC占80%以上[2]。由于NSCLC细胞增殖、迁移较快，多数患者在就诊时已处于中晚期，错过最佳的手术治疗时间，5年生存率较低[3]。从分子水平探究发展病因，对NSCLC的靶向分子治疗具有重要作用。近年研究显示，微小RNA-32-5p(miR-32-5p)参与调控胰腺癌、前列腺癌、肝细胞癌等肿瘤细胞的增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为，与肿瘤的发生发展密切相关[4～6]。孙昱等[7]发现，NSCLC组织中miR-32呈低表达，其可作为NSCLC诊断的分子标志物。目前，miR-32-5p对NSCLC细胞生物学行为的影响及作用机制尚不清楚。生物信息学软件预测显示，FK506结合蛋白14(FKBP14)的3′非编码区(3′UTR)存在与miR-32-5p相结合的位点，提示miR-32-5p调控FKBP14表达。研究[8,9]显示，FKBP14在骨肉瘤、胃癌等肿瘤中发挥重要作用，但其对NSCLC的影响也还未知。2019年2～10月，本研究观察了miR-32-5p和FKBP14基因转染对人NSCLC细胞系SPC-A1增殖、迁移、侵袭能力的影响，并验证其靶向关系，以期为NSCLC的靶向分子治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞、转染物及主要试剂 NSCLC细胞系SPC-A1、A549、H460和正常肺上皮细胞系EBAS-2B来源于中国科学院上海细胞库。miR-32-5p模拟物(mimics)、模拟对照物、miR-32-5p抑制剂、抑制剂对照物、FKBP14过表达载体购自上海吉凯基因公司。胎牛血清、RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，四甲基噻唑蓝(MTT)、胰蛋白酶购自美国Sigma公司，TRIzol试剂、逆转录试剂盒、PCR试剂盒购自美国Fermentas公司，PCR引物序列购自上海生工生物工程公司，兔抗人细胞周期蛋白D1、MMP-2、MMP-9多克隆抗体购自美国Abcam公司，FKBP14抗体购自以色列ProSpec-Tany公司，LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司，BCA蛋白测定试剂盒购自上海碧云天公司，双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司。

1.2 NSCLC细胞系的选择 取SPC-A1、A549、H460、EBAS-2B细胞，均加入含10%胎牛血清的RPMI1640培养基培养，置于37 ℃、5%CO2、湿度97%的培养箱中。每2～3天更换1次新鲜培养基。待细胞融合至80%左右时，吸弃培养基，加入适量磷酸盐缓冲液(PBS)清洗细胞后，0.25%胰蛋白酶溶液消化细胞，进行传代培养。将各细胞调整浓度为0.5×103个/mL，以每孔1.0 mL接种于24孔细胞培养板中，培养24 h后，收集细胞。qRT-PCR检测细胞中miR-32-5p、FKBP14 mRNA，Western blotting法检测FKBP14蛋白。SPC-A1、A549、H460、EBAS-2B细胞miR-32-5p mRNA相对表达量分别为0.42±0.04、0.30±0.03、0.38±0.05、1.00±0.10，FKBP14 mRNA相对表达量分别为2.01±0.20、1.88±0.18、2.25±0.22、1.00±0.10，FKBP14蛋白相对表达量分别为0.90±0.09、0.88±0.08、0.75±0.07、0.25±0.03，SPC-A1、A549、H460细胞分别与EBAS-2B细胞比较，P均<0.05。SPC-A1细胞与EBAS-2B细胞比较差异最为显著，根据以上结果，选择SPC-A1细胞作为本研究的实验细胞。

1.3 转染miR-32-5p+pcDNA-FKBP14、miR-32-5p+pcDNA、miR-32-5p、miR-con、pcDNA-FKBP14、pcDNA-con的SPC-A1细胞存活率测算 采用MTT法。SPC-A1细胞以1×105个/孔细胞接种于6孔细胞培养板中，参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书，分别转染miR-32-5p+pcDNA-FKBP14、miR-32-5p+pcDNA、miR-32-5p、miR-con、pcDNA-FKBP14、pcDNA-con，分别记为A、B、C、D、E、F组。转染6 h后，更换培养基，在培养24 h，收集细胞。然后调整细胞浓度为0.5×103个/mL，以每孔0.2 mL接种于96孔细胞培养板中，培养48 h后，每孔加入20 μL浓度为5 g/L的MTT溶液，继续孵育4 h。取出细胞培养板，吸弃培养基，加入150 μL二甲基亚砜，充分溶解结晶紫，振荡混匀后，于酶标仪490 nm处测定吸光度(A)值，并计算细胞存活率。细胞存活率(%)=A实验组/A对照组×100%。

1.4 转染miR-32-5p+pcDNA-FKBP14、miR-32-5p+pcDNA、miR-32-5p、miR-con、pcDNA-FKBP14、pcDNA-con的SPC-A1细胞迁移细胞数、侵袭细胞数检测 采用Transwell实验。SPC-A1细胞转染方法和分组同“1.3”。收集各组细胞，用不含FBS的RPMI1640培养基调整浓度为5×104个/mL。细胞迁移实验：取100 μL细胞悬液，加入Transwell上室。下室加入500 μL含10 % FBS的RPMI1640培养基。培养48 h后，4%多聚甲醛固定30 min，0.4%结晶紫染色15 min，倒置显微镜观察，随机选取5个视野，对迁移细胞进行计数。细胞侵袭实验：先将Matrigel基质胶用RPMI1640培养基稀释(1∶8)，铺于Transwell上室，自然晾干后，加入100 μL细胞悬液，后续操作同细胞迁移实验。

1.5 转染miR-32-5p+pcDNA-FKBP14、miR-32-5p+pcDNA、miR-32-5p、miR-con、pcDNA-FKBP14、pcDNA-con的SPC-A1细胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白检测 采用Western blotting法。SPC-A1细胞转染方法和分组同“1.3”。收集各组细胞，使用RIPA蛋白裂解液提取细胞中总蛋白，BCA法对蛋白进行定量，按照30 μg/每泳道蛋白进行SDS-PAGE电泳。电泳后，湿转至硝酸纤维素膜。转膜后，将其置于5%脱脂奶粉中进行封闭，时间1 h。分别置于CyclinD1(1∶800)、MMP-2(1∶1 000)和MMP-9(1∶1 000)一抗孵育液中，4 ℃孵育过夜。置于山羊抗兔二抗(1∶3 000)孵育液中，室温孵育1 h。加化学发光试剂，避光显影后，凝胶成像系统曝光拍照，Image J软件分析蛋白条带灰度值。以β-actin为内参，目前蛋白与β-actin条带灰度值的比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.6 miR-32-5p与FKBP14靶向关系、调控作用验证 ①靶向关系：PCR扩增含miR-32-5p结合位点的FKBP14的3′UTR序列，构建FKBP14野生型质粒(FKBP14-WT)和突变型质粒(FKBP14-MUT)。SPC-A1细胞分为G、H、I、J组，参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书，分别转染FKBP14-WT+miR-con、FKBP14-WT+miR-32-5p、FKBP14-MUT+miR-con、FKBP14-MUT+miR-32-5p。转染6 h后，更换培养基。继续培养24 h后，收集细胞。参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作说明，检测荧光素酶活性，以荧光虫荧光/海肾荧光的比值表示各组的荧光素酶活性。②调控作用：采用Western blotting法。SPC-A1细胞以1×105个/孔细胞接种于6孔细胞培养板中，分为K、L、M、N组。参照LipofectamineTM2000试剂盒说明书，分别转染miR-32-5p、miR-con、anti-miR-32-5p、anti-miR-con。转染6 h后，更换培养基，在培养24 h，收集细胞，检测细胞中FKBP14蛋白表达，具体操作步骤同“1.5”，其中FKBP14抗体稀释度1∶1 000。

2 结果

2.1 各组细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较 细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较见表1。

表1 各组细胞存活率、迁移细胞数、侵袭细胞数比较

2.2 各组细胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量比较 细胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量比较见表2。

表2 各组细胞CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白相对表达量比较

2.3 各组细胞荧光素酶活性及FKBP14蛋白相对表达量比较 G、H组细胞荧光素酶活性分别为1.00±0.12、0.42±0.04，两组比较P<0.05；I、J组细胞荧光素酶活性分别为1.05±0.16、1.02±0.11，两组比较P>0.05。K、L组FKBP14蛋白相对表达量分别为0.42±0.04、0.90±0.11，M、N组KBP14蛋白相对表达量分别为1.32±0.12、0.92±0.10，两组比较，P均<0.05。

3 讨论

NSCLC是常见的恶性肿瘤疾病，具有较高的发病率和致死率[10]。目前，NSCLC的治疗手段主要有手术切术、放疗和化疗等。近年来，随着治疗手段和技术的提高，NSCLC的治疗有了较大提高，但由于NSCLC发病隐匿，早期缺乏典型特征[11]。临床资料显示，多数NSCLC患者在确诊时已处于中晚期，癌细胞已浸润周围正常组织，错过最佳手术治疗时间[12]。目前，NSCLC的发病机制尚未明确，因此探讨影响NSCLC发生发展的机制，并寻找用于其治疗的分子靶点具有重要意义。

miRNA是一类长度约为18～25个核苷酸的小分子单链非编码RNA，其可在转录后水平与靶基因mRNA的3′UTR结合抑制靶基因的表达，参与调控细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等，在肿瘤发生发展中起重要作用[13]。Wang等[14]发现，miR-32-5p通过直接与孤核受体TR4 mRNA的3′UTR结合抑制TR4蛋白表达，进而抑制透明细胞肾细胞癌细胞的迁移和侵袭。郭明等[15]认为，miR-32-5p通过靶向作用于果蝇zeste基因增强子同源物2的3′UTR的特异序列，抑制EZH2基因的表达，降低口腔癌CAL-27细胞的增殖能力。Liu等[16]的研究显示，上调miR-32-5p表达可通过抑制同源盒B8表达减弱宫颈癌HeLa细胞的增殖，克隆形成及侵袭、迁移能力。生物信息学软件预测显示，FKBP14是miR-32-5p的靶基因。FKBP14属于FK506结合蛋白家族成员，因其基因突变在人类中会导致一种特殊类型结缔组织病而受到广泛关注。随着对FKBP14研究的深入，发现其也参与肿瘤的发生发展。研究[17]显示，胃癌组织和细胞系中FKBP14表达升高，敲减FKBP14表达显著抑制胃癌MKN-45和AGS细胞的增殖、黏附和侵袭能力。miR-361通过靶向下调FKBP14表达抑制骨肉瘤细胞系的侵袭和增殖，可作为骨肉瘤治疗的潜在作用靶点[18]。目前，FKBP14对NSCLC的影响还未见相关报道。本研究显示，过表达miR-32-5p或敲减FKBP14后，SPC-A1细胞的存活率、迁移细胞数和侵袭细胞数均明显降低，说明过表达miR-32-5p或敲减FKBP14均可抑制SPC-A1细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示miR-32-5p、FKBP14参与NSCLC的发生发展，二者可能是NSCLC靶向治疗的新靶点。

CyclinD1是细胞周期调控蛋白，其表达增加可促进细胞周期由G1期向S期转变，加速细胞增殖[19]。研究显示，过表达miR-149可抑制结肠癌细胞株SW480中CyclinD1的表达，抑制SW480增殖[20]。基质金属蛋白酶是一类可水解细胞外基质和基底膜的酶类，参与调控细胞迁移和侵袭。目前，对MMP-2和MMP-9在肿瘤中的研究最为广泛，其表达增加可通过水解细胞外基质促进肿瘤细胞迁移和侵袭[21]。研究显示，过表达miR-142-3p可通过抑制MMP-2和MMP-9蛋白的表达降低NSCLC细胞株的迁移和侵袭能力[22]。本研究显示，过表达miR-32-5p或敲减FKBP14均可明显降低SPC-A1细胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9的蛋白表达，进一步说明过表达miR-32-5p或敲减FKBP14抑制了SPC-A1细胞的增殖、迁移和侵袭能力。本研究通过双荧光素酶报告基因实验证实了miR-32-5p可与FKBP14的3′UTR靶向结合，且miR-32-5p过表达后，SPC-A1细胞中FKBP14蛋白表达降低，而敲减miR-32-5p过表达后，FKBP14蛋白表达升高，进一步证实了miR-32-5p靶向负调控FKBP14表达。此外，过表达FKBP14逆转了miR-32-5p过表达对SPC-A1细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，且过表达FKBP14逆转了过表达miR-32-5p对SPC-A1细胞中CyclinD1、MMP-2和MMP-9的蛋白表达的抑制作用，说明miR-32-5p过表达通过靶向抑制FKBP14来降低SPC-A1细胞的增殖、迁移和侵袭能力。

总之，过表达miR-32-5p可降低NSCLC细胞系SPC-A1的增殖、迁移和侵袭能力，其作用机制与下调FKBP14表达有关，此为NSCLC的靶向分子治疗提供了新靶点。