SIVA1基因在胃癌组织中的表达变化及与化疗药物敏感性的关系

吴锟，孔凡彪，李雷，麦威，王晓通

1广西壮族自治区民族医院，南宁 530021；2广西壮族自治区人民医院

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和肿瘤相关致死率在所有恶性肿瘤中分别位居第四和第三[1]。化疗对改善进展期胃癌和复发转移型胃癌患者预后发挥重要作用，然而目前仍缺乏个体化治疗方案选择的有效指标，且化疗过程中发生肿瘤耐药也是导致化疗后肿瘤复发或转移的主要原因之一。因此，积极寻找具有判断个体化疗敏感性的指标，优化化疗个体治疗方案，并切实有效地提高化疗疗效，对胃癌化疗具有重要的意义，也是临床迫切需要解决的难题。我们前期研究发现，通过干扰胃癌细胞中SIVA1基因表达，可促进胃癌增殖，抑制胃癌凋亡，并增强胃癌对顺铂(CDDP)的耐药性[2]。本研究采用免疫组化法检测胃癌组织中SIVA1，三维组织块体外药敏法检测CDDP、5-氟尿嘧啶(5-FU)、多柔比星(ADM)对胃癌组织的抑制率，分析SIVA1表达与胃癌组织对药物敏感性的相关性，初步探讨SIVA1在指导胃癌个体化治疗中的潜在应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料 选取2017年7月～2018年10月广西壮族自治区人民医院胃肠外科手术切除的新鲜胃癌组织和匹配的正常组织，胃癌组织经术后病理确诊，且所有患者术前均未接受放化疗和生物治疗。标本收集及处理：大体标本离体后，剖开胃体，用无菌纱布将肿瘤表面的血渍、黏液等污物擦拭干净，避开肉眼可见的肿瘤坏死区域，分别切取新鲜胃癌组织和正常组织(距离癌肿边缘3 cm以上)各2 cm3，将癌组织分为2部分，用于病理诊断和检测SIVA1表达的癌组织(60例份)则置入4%多聚甲醛中，正常组织(60例份)也置入4%多聚甲醛进行固定，用于体外培养药敏实验的癌组织(30例份)放入含有双抗(100 U/mL青霉素和100 U/mL链霉素)的预冷磷酸盐缓冲液(PBS)中；4 ℃条件下，将上述组织样本在30 min内快速送至实验室。进行药敏实验的组织经过含双抗的PBS漂洗数次去除黏液、血液等，眼科剪将其剪成大小约1 mm3的微组织块并称取其重量；其余组织标本经甲醛固定24 h后，按常规石蜡包埋技术进行组织石蜡标本的制作，收集石蜡切片进行免疫组化实验。

1.2 胃癌组织SIVA1检测 采用免疫组化SP法。实验操作步骤按试剂盒说明书进行，以PBS代替一抗做阴性对照，用抗体说明书上的已知阳性切片作阳性对照。由两位中级职称以上的病理医师分别双盲阅片进行结果判读，每张切片随机取5个高倍视野(400×)，每视野计数100个细胞。细胞染色强度定义和记分：无染色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分；组织阳性细胞率定义和记分：阳性细胞≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，≥76%为4分；SIVA1表达强度为细胞染色强度记分和组织阳性细胞率记分乘积值：1表示阴性(-)，2～3为弱阳性(+)，4～7为阳性(++)，≥8为强阳性(+++)。定义表达强度≤3为表达阴性，≥4为表达阳性。

1.3 胃癌组织药物敏感实验 采用三维组织块药敏法(HDRA)进行药物敏感性检测[3～5]。具体操作步骤：在24孔板中每孔放入1份组织块，随后加入含有药物的完全培养液，所加入的培养液以不致组织块漂浮为准，每一种药物设置6个重复孔，以不含药物的培养液作为阴性对照组，放入37 ℃细胞培养箱继续培养1周，培养期间更换培养液1次；弃去培养液，加入100 μL浓度为5 mg/mL的MTT溶液以及100 μL浓度为0.1 mg/mL胶原酶溶液，与组织块反应8 h；弃去上述液体，加入400 μL的DMSO溶解结晶紫，用酶标仪检测波长为540 nm处的吸光度值。计算各药物对肿瘤组织的抑制率=(1-T/C)×100%，其中T为实验组每克肿瘤组织的吸光值，C为对照组每克肿瘤组织的吸光值。药物的抑制率为每种受试药物6孔抑制率的平均值。根据药物在人体内的血浆峰浓度设定HDRA试验中药物测试浓度：CDDP测试浓度为20 μg/mL，5-FU测试浓度为300 μg/mL，ADM测试浓度为15 μg/mL[6～8]。

2 结果

2.1 胃癌和正常组织中SIVA1阳性率比较 胃癌和正常组织中SIVA1阳性率分别为25.0%(15/60)、88.3%(53/60)，两者比较，P<0.05。胃癌和胃正常组织中SIVA1免疫组化染色情况(详见图1)。

图1 胃癌和胃正常组织中SIVA1免疫组化染色情况

2.2 胃癌组织SIVA1阳性表达与化疗药物敏感性的关系 CDDP、5-FU、ADM对胃癌组织的抑制率分别为28.81%、28.20%、25.45%；以SIVA1表达强度为中位值将30例份胃癌组织分为相对高表达组(14例份)和相对低表达组(16例份)，CDDP、5-FU、ADM对相对低表达组的抑制率分别为23.40%±1.91%、30.94%±3.94%、29.20%±2.23%，三种药物对相对高表达组的抑制率分别为34.59%±2.11%、26.71%±5.29%、25.44%±2.39%，两组CDDP抑制率比较，P均<0.05。

3 讨论

目前，胃癌患者接受的化疗方案主要遵循美国国立综合癌症网络(NCCN)指南推荐的标准方案，然而在临床应用过程中，这些标准化的治疗方案却忽略了肿瘤内在的异质性以及患者的个体化差异。由于肿瘤异质性以及个体差异的存在，使得不同的胃癌患者即便在接受相同的化疗方案后，其生存结局亦有明显差异，因此如何在选择化疗方案的过程中体现“精准个体化治疗”是当前胃癌治疗的主要研究方向。类似于细菌体外培养并进行药敏实验指导感染患者的针对性治疗，肿瘤药敏实验在理论上也能指导临床医生制订并为患者选择合适的化疗方案。经过多年的研究，学者们深入探索了各种实体肿瘤在体外培养和药敏实验的方法，并将这些方法与患者的治疗效果进行分析[9～11]。相对于肿瘤原代细胞培养等其他实验方法，三维组织块药敏法(HDRA)具有操作便利性、实验周期短、维持肿瘤组织三维组织结构等多种体内特性、可模拟细胞间质和细胞间相互信息传导等优势，更接近于肿瘤在体内实际情况[12～14]。因此在本研究中，我们采用HDRA体外培养法对胃癌组织进行药敏实验，结果显示30例胃癌标本均成功进行药敏实验，且实验结果经过标准化处理后相同药物浓度对不同胃癌患者来源的肿瘤组织的抑制率存在不同程度的差异，提示HDRA法的可操作性。然而在实验过程中仍需注意：①考虑到同一患者的肿瘤组织局部亦存在异质性，因此应设置多个重复孔；②组织块的吸光度值应经过组织块重量的标准化处理，方有比较意义；③在处理组织块时应使用含双抗的PBS反复洗去表面的黏液和血渍等污物，以避免体外组织培养过程中发生病原微生物污染。

化疗药物杀伤肿瘤的一个重要作用方式是通过损伤细胞基因组DNA进而诱导细胞凋亡的发生，而DNA损伤修复增强、促进凋亡抵抗则是肿瘤耐药发生的主要机制[15]，因此当凋亡相关分子或信号通路功能异常则可诱导肿瘤细胞发生化疗耐药。凋亡影响因子SIVA1不仅能参与p53引起的细胞凋亡[16]，还可通过抑制NF-κB的活性并诱导细胞发生凋亡[17]。此外，SIVA1还参与肿瘤细胞的化疗耐药过程。研究[18,19]表明，SIVA1可通过与多种受体结合并促进肿瘤细胞凋亡，从而增加肿瘤细胞对CDDP的敏感性。Ray等[20]发现，在p53缺失的结直肠癌细胞中，低表达的SIVA1是CDDP发挥诱导细胞凋亡作用的主要障碍之一。以上研究提示，SIVA1可通过影响细胞凋亡发挥抑癌基因的作用并参与肿瘤化疗耐药过程。我们此前研究也发现，下调胃癌耐CDDP的细胞株中的SIVA1表达后，细胞的耐药性显著增加且引起抗凋亡因子Bcl-2表达升高，提示SIVA1可通过细胞凋亡途径调控胃癌细胞对CDDP的药物敏感性。本研究显示，SIVA1在胃癌组织中呈低表达，提示SIVA1作为抑癌基因参与胃癌的发生及发展。本研究还显示，相比于低表达的组织，CDDP对SIVA1表达较高的胃癌组织具有更高的抑制率，提示SIVA1的表达水平可能对CDDP在胃癌中的治疗具有一定参考作用；然而对于SIVA1与ADM、5-FU药物敏感之间未见显著性关联，我们推测可能是SIVA1介导的凋亡相关信号通路与上述两种药物的作用机制不同所致，但这一推测仍需要进一步研究。

总之，SIVA1在胃癌组织中呈低表达，HDRA法能有效检测化疗药物在体外对胃癌组织的抑制效应，胃癌组织中SIVA1表达与CDDP对胃癌组织的抑制率呈正相关，SIVA1可作为评价CDDP对胃癌治疗效果的指标。