野生蔓越莓活悦饮的制备及其体内抗氧化功能研究

石 杰，李宝龙， 刘宇峰，王娇娇，段婷婷，董 艳

（1. 黑龙江省科学院 大庆分院，黑龙江 大庆 163319；2. 黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040）

0 引言

野生蔓越莓（Vaccinium Vitis-idaeaL.） 属于杜鹃花科越橘属植物，又名牙疙瘩、红豆、红果，分布于东亚、北美、北欧的高山地带[1-2]。通过查阅中华药典，根据药性相生相克研制出了针对女性日常引用的功能饮品——野生蔓越莓活悦饮。以野生蔓越莓冻果榨汁去果胶为基础饮料，将野生蔓越莓与马来西亚国宝——卡琪花蒂玛、红花、枸杞提取物进行配伍，辅以蔗糖、木糖醇或三氯蔗糖制备而成的功能型无醇果汁饮品，不添加任何防腐剂，具有浓郁的蔓越莓果香和酸甜清凉的草本口味，色泽红润明亮、质量稳定、口感爽滑细腻、营养价值高，具有增强女性免疫能力、改善内分泌紊乱、提高女性性功能、提神醒脑、预防妇科炎症、细肤美颜等作用。

1 材料与试剂

1.1 野生蔓越莓活悦饮的制备

野生蔓越莓，大兴安岭冰莓庄园生物发展有限公司提供；红花、枸杞，购买于药店；卡琪花蒂玛的干燥根叶，购买于马来西亚；果胶酶、矿泉水，均为食品级。

1.2 饮料抗氧化性试验

试验动物：SPF 级ICR 小鼠60 只，辽宁长生生物技术有限公司提供，试验动物许可证号：SCXK（辽） 2015- 0001。

试验条件：黑龙江中医药大学实验动物中心（屏障环境），许可证号：SYXK （黑） 2016- 004，温度21～25℃，湿度40%～70%。SPF 级试验动物饲料，北京科澳协力饲料有限公司提供，许可证号：SCXK（京） 2014- 0010。

1.3 急性、毒性研究

（1） 受试物。野生蔓越莓活悦饮（原花青素含量为4.629 66 mg/mL），溶于水，稳定。供试品采用蒸馏水配制，配制频率为试验当天配制1 次，配制提供样品的3 倍浓缩液。

（2） 试验动物。Wistar 大鼠，SPF 级，雌雄各半，共20 只，初始体重范围为90～100 g，使用时体重范围118.5～129.0 g，辽宁长生生物技术股份有限公司提供（动物合格证号： SCXK- （辽） 2015-0001）。动物购入后，首先进行预分笼，给一个临时预分号并测定购入日体重。从购入日算作第1 天，检疫与驯化期共为7 d。期间对于外观、状态出现异常，可能对试验有影响的动物在试验时剔除[3]。分组方法：雌、雄动物禁食16 h 后分别按体重分组；识别方法：检疫驯化期采用尾部标记动物编号，正式试验采用皮毛标记编号，并在笼具上标明试验研究号、组别、性别及笼号。

（3） 试验动物饲养管理的环境条件。饲养室采用屏障系统，温度设定21～25 ℃，湿度设定40%～70%，换气次数10～20 次/ h，昼夜明暗交替时间12/12（6:00～18 :00 采用动物照明控制系统）。

（4） 饲养条件。笼具为PC 聚碳酸酯鼠盒（长×宽× 高= 40 cm×25.5 cm×20 cm），饲养密度5 只/盒，笼具交换2 次/ 周，粪便处理需要更换鼠盒及垫料（周一、周四），每天全部试验结束后，由动物室人员进行常规消毒。

（5） 饲料及饮用水。全价颗粒饲料由北京科澳协力饲料有限公司提供，钴60 辐照灭菌自由摄取。饮用水采用高压灭菌自来水，由动物饮水瓶自由摄取，经检测符合城市饮用水标准。

2 仪器与设备

破碎机、超声波仪、鼓风干燥箱、连续光谱酶标仪、可见光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、离心机、组织匀浆器；丙二醛（MDA） 测定试剂盒、还原型谷胱甘肽（GSH） 测定试剂盒、蛋白质羰基测定试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD） 测定试剂盒、蛋白定量测试盒，均由南京建成生物技术有限公司提供。

3 研究方法

3.1 野生蔓越莓果胶处理试验

试验采用单因素试验设计，设置3 个处理：①野生蔓越莓冻果50 g + 果胶酶0.32 g + 常温过夜；②野生蔓越莓冻果50 g + 果胶酶0.32 g + 50 ℃0.5 h + 常温1 h；③野生蔓越莓冻果50 g + 果胶酶0.32 g + 常温过夜+ 50 ℃1.5 h。观测果汁澄清度[4]。

3.2 野生蔓越莓活悦饮制备

红花按照日推荐量为3 g，枸杞按照日推荐量5 g，原花青素按照日推荐量100 mg，野生蔓越莓原花青素含量为0.827 3%，推算后为12 g 进行配比制备。该野生蔓越莓无醇活悦饮日推荐量为25 mL。

3.2.1 红花提取物的制备

称取红花23.16 g，以1∶1 的体积比浸泡于桶装矿泉水中1 h，于65 ℃下超声处理0.25 h 后过滤，收集滤液后以1∶1 的体积比加入桶装矿泉水于红花残渣中，继续于65 ℃下超声处理0.25 h 后过滤，反复3 次，分别收集滤液和残渣。

3.2.2 枸杞提取物的制备

称取枸杞38.60 g，以1∶2 的体积比浸泡于桶装矿泉水中1 h，于65 ℃下超声处理0.25 h 后过滤，收集滤液后以1∶2 的体积比加入桶装矿泉水于枸杞残渣中，继续于65 ℃下超声处理0.25 h 后过滤，反复3 次，分别收集滤液和残渣。

3.2.3 卡琪花蒂玛提取物的制备

称取卡琪花蒂玛根叶混合物39.70 g，采用泰斯特万能粉碎机（型号FW100） 进行粉碎，以1∶2 的体积比浸泡于75%的食用酒精中1 h，于65 ℃下超声处理1 h 后过滤，收集滤液后再以1∶2 的体积比加入75%的食用酒精于残渣中，继续于65 ℃下超声处理1 h 后过滤，反复5 次，收集滤液共1.5 L。滤液采用上海申胜生物技术有限公司生产的旋转蒸发仪（型号R201） 进行浓缩，温度50 ℃，转速45 r/min。浓缩后体积约为100 mL。置于鼓风干燥箱中50 ℃下风干，获得提取物固形物，使用研钵磨碎收集。

3.2.4 野生蔓越莓冻果前处理

称取野生蔓越莓冻果1 403 g，解冻捏碎，按照0.3%的比例加入果胶酶混合过夜，于50 ℃下水浴0.5 h，得果碎混合物[5]。

3.2.5 野生蔓越莓活悦饮原汁的制备

将果胶酶处理后的野生蔓越莓果碎混合物与3.2.1，3.2.2 中收集的红花、枸杞滤渣混合，加入新鲜洗净的薄荷叶10 片左右，使用JYZ- V911 型榨汁机加入3.2.1，3.2.2 中收集的红花、枸杞滤液榨汁约2 L 进行榨汁，分别收集汁液及果渣。向果渣中加入0.8 L 桶装矿泉水再次榨汁，收集汁液与之前汁液混合，弃去果渣。在汁液中加入7 g 卡琪花蒂玛提取物固形物粉末混匀，此即为野生蔓越莓活悦饮原汁[6]。

3.2.6 调配

采用200 目滤布过滤野生蔓越莓活悦饮原汁。原汁按照不同饮用需要分别使用3 个不同糖分添加量及添加方式。

3.3 饮料抗氧化性试验

3.3.1 D - 半乳糖氧化损伤模型建立

选25～30 g 健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D - 半乳糖1.0 g/kg·bw 腹腔注射造模，注射量为0.1 mL/10 g，每日1 次，连续造模6 周，取血测MDA，按MDA 水平分组，随机分为1 个模型对照组和3 个受试样品剂量组。

3.3.2 剂量设计分组及受试样品给予时间

试验设高、中、低3 个剂量组，分别为人体推荐量的5 倍，10 倍和30 倍，即11.023，22.046，66.138 g/kg·bw。准确称取野生蔓越莓活悦饮混匀定容至20 mL，分别作为高、中、低3 个剂量经口给予受试小鼠。另设空白对照组和模型对照组，共5 组，每组12 只。空白对照组和模型对照组均给予等容积蒸馏水，试验小鼠按体重的2%灌胃容积进行灌胃[7]，在给受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量D - 半乳糖腹腔注射，每日1 次，连续灌胃30 d 后处死动物，测血清及肝组织中脂质氧化产物丙二醛（MDA） 含量、抗氧化物质还原型谷胱甘肽（GSH） 含量、蛋白质氧化产物蛋白质羰基含量及抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶（SOD） 活力[8]。

3.3.3 丙二醛（MDA） 含量测定

按试剂盒的要求测血清及10%肝均浆中MDA含量[9]。

①血清（浆） 中MDA 含量。

样品测试前稀释倍数.

注：样本测试前稀释倍数= 上清液制备时稀释倍数 （5 倍）。

②组织中MDA 含量。

待测样本蛋白浓度（mgprot/ml） .

注：*nmol/mgprot 为纳摩尔/ 毫克蛋白。

3.3.4 还原型谷胱甘肽（GSH） 含量测定

按试剂盒的要求测血清及10%肝均浆中GSH含量[10]。

①血浆中GSH 含量。

GSH 分子量（307）×样品测试前稀释倍数

注：标准品浓度为20 μmol/L=20×10-6mol/L；样本测试前稀释倍数= 上清液制备时稀释倍数（5 倍）。

②组织中GSH 含量。

GSH 分子量（307）×样本测试前稀释倍数÷

待测匀浆蛋白浓度（gprot/L） .

注：样本测试前稀释倍数= 上清液制备时稀释倍数 （5 倍）

3.3.5 蛋白质羰基含量测定

按试剂盒的要求测血清及10%肝均浆中蛋白质羰基含量[11]。

①血清（浆） 中蛋白质羰基含量。

②组织中蛋白质羰基含量。

3.3.6 超氧化物歧化酶（SOD） 活力测定

按试剂盒的要求测血清及10%肝均浆中SOD活力[12]。

注：mgprot* 为毫克蛋白数。

3.3.7 蛋白质定量测试（考马斯亮蓝法）

按试剂盒的要求测血清及10%肝均浆中蛋白含量[13]。

3.3.8 试验数据处理

用Excel 软件建立数据库，用SPSS 软件进行方差分析，需按方差分析的程序先进行方差齐性检验。计算F 值。F 值＜F0.05，结论为各组均数间差异无显著性；F 值≥F0.05，p≤0.05，再用多个试验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐性要求后，用转换后的数据进行统计[14]。

3.4 饮料急性毒性试验

（1） 灌胃途径及方法。禁食16 h 后灌胃给予[15]。

（2） 灌胃剂量。设一个剂量组。

剂量设计见表1。

（3） 剂量设计理由。根据预试验结果（按设计剂量未测得LD50），以允许的最大质量浓度（10 倍原液浓缩） 及动物最大灌胃容积1 次，7 d 内无一死亡，未见毒性反应，进行最大剂量测定。

表1 剂量设计

（4） 灌胃频率。分组当天给1 次。

（5） 观察内容。观察动物体重、精神状态、毛色、呼吸、自主活动、饮食、二便、口鼻分泌物，以及死亡和恢复的时间等[16]。

（6） 观察例数。灌胃后全部试验动物。

（7） 观察次数。灌胃后4 h 内连续观察，然后每天上下午各观察1 次，连续观察14 d。

（8） 体重测定方法。采用 “BMS420.3 型电子天平（上海卓精产品）” 测定。

（9） 体重测定例数。灌胃前全部购入动物，灌胃后全部试验动物。

（10） 体重测定次数。购入日、动物分组（灌胃第1 天） 时、灌胃后每2 d 各测定1 次。

（11） 解剖方法。动物脱臼处死后，进行解剖。剖检时对动物外表、全身各脏器进行肉眼观察。若发现异常则作组织病理学检查。

（12） 解剖时间。动物死亡后即刻及整个试验观察结束。

（13） 解剖例数。灌胃后全部试验动物。

体重采用Microsoft 公司Excel 软件进行统计。

4 结果与分析

4.1 野生蔓越莓果汁澄清试验

试验主要采用果胶酶及作用时间的调试，发现0.64%果胶酶添加量，常温过夜后于50 ℃下加热90 min 可以得到较澄清的蔓越莓果汁。

野生蔓越莓果汁澄清试验见表2。

表2 野生蔓越莓果汁澄清试验

4.2 过氧化损伤模型的建立，D - 半乳糖造模后小鼠血清中MDA 含量的影响

D - 半乳糖造模后小鼠血清中MDA 含量的影响见表3。

由表3 可见，以D - 半乳糖1.0 g/kg·bw 每日腹腔注射造模6 周后，模型组小鼠血清中MDA 含量明显增加，与空白对照组比较差异有极显著性（p＜0.01），说明过氧化损伤模型成立。

表3 D - 半乳糖造模后小鼠血清中MDA含量的影响（X±SD）

4.3 野生蔓越莓活悦饮对过氧化损伤模型小鼠MDA的影响

野生蔓越莓活悦饮对小鼠血清及肝组织中MDA含量的影响见表4。

表4 野生蔓越莓活悦饮对小鼠血清及肝组织中MDA 含量的影响 （X±SD）

由表4 可见，与模型对照组比较，中、高剂量组小鼠血清和肝组织中MDA 的含量差异均有显著性（p＜0.05 或p＜0.01）[16]。

4.4 野生蔓越莓活悦饮对GSH 的影响

野生蔓越莓活悦饮对小鼠血清及肝组织中GSH含量的影响见表5。

表5 野生蔓越莓活悦饮对小鼠血清及肝组织中GSH 含量的影响 （X±SD）

野生蔓越莓活悦饮果汁样品中原花青素含量为4.629 66 mg/mL。研究表明，原花青素人体推荐使用量为2.204 6 mg/kg·bw。人体标准体重为60 kg，每天喝132.276 mg/d，相当于28.57 mL。

由表5 可见，与模型对照组比较，高剂量组血清和中、高剂量组肝组织中还原型谷胱甘肽差异均有显著性 （p＜0.05 或p＜0.01）。

4.5 野生蔓越莓活悦饮对蛋白质羰基的影响

野生蔓越莓活悦饮对小鼠血清及肝组织中蛋白质羰基含量的影响见表6。

由表6 可见，与模型对照组比较，各剂量组小鼠血清及肝组织蛋白质羰基含量差异均无显著性（p＞0.05）[17]。

表6 野生蔓越莓活悦饮对小鼠血清及肝组织中蛋白质羰基含量的影响（X±SD）

4.6 野生蔓越莓活悦饮对SOD 活力的影响

野生蔓越莓活悦饮对小鼠血清及肝组织中SOD活力的影响见表7。

由表7 可见，与模型对照组比较，中、高剂量组血清和肝组织中SOD 活力差异均有显著性（p＜0.05或p＜0.01）。

表7 野生蔓越莓活悦饮对小鼠血清及肝组织中SOD 活力的影响 （X±SD）

4.7 野生蔓越莓活悦饮对过氧化损伤模型小鼠体重的影响

野生蔓越莓活悦饮对小鼠体重（g） 的影响见表8。

由表8 可见，给予受试物30 d，各剂量组小鼠的体重与模型对照组比较差异均无显著性（p＞0.05）[18]。

表8 野生蔓越莓活悦饮对小鼠体重（g） 的影响（X±SD）

4.8 急性毒性研究中体重变化

在试验中，试验前和试验结束时各受试动物体重均呈一定程度的增长，说明该供试品灌胃后未影响受试动物生长[19]。

对大鼠体重的影响见表9。

表9 对大鼠体重的影响（X±S，n=10）

4.9 急性毒性研究中毒性反应

在灌胃后直至试验结束，大鼠一般状态良好，毛顺光亮，活动和饮食正常，粪便成型。无一动物死亡。

4.10 急性毒性研究中解剖所见

试验结束次日，所有动物均进行了大体解剖观察，肉眼未发现器官出现体积、颜色、质地等改变，特别观察了心、肝、脾、肺、肾、脑、胃肠等重要脏器。检查结果未见出血、充血、渗出、溃疡、穿孔、炎症，胸腔、腹腔及心包腔均无积液。

4.11 急性毒性研究中大鼠最大灌胃量

（1） 大鼠最大灌胃量测定。结果表明，动物数20只，给药质量浓度46.3 mg/mL，每次给药容积2 mL/100 g，给药次数1 次/ d，给药剂量6 g/kg，观察时间14 d，无死亡。

（2） 微生物指标测定。根据GB 4789.2—2010 食品菌落总数标准测定野生野生蔓越莓活悦饮的细菌总数（CFU/g） ≤10 个/mL，并且未检出致病菌。

（3） 野生蔓越莓活悦饮保质期测定。于2017 年5 月份制备的野生野生蔓越莓活悦饮在自然条件下贮存12 个月，未发现沉淀物和其他任何异常现象。同时测定了菌落总数，结果仍为（CFU/g） ≤10 个/mL，可见蔓越莓具有很强的抑制细菌的性能。

5 结论

0.64 %果胶酶加入量，常温过夜后于50 ℃下加热90 min 可以得到较澄清的蔓越莓果汁。根据原花青素、红花、枸杞、卡琪花蒂玛的日推荐量配比制备了野生蔓越莓活悦饮。

经口给予过氧化损伤模型小鼠66.138，22.046，11.023 g/kg·bw（相当于人推荐剂量的30 倍，10 倍，5 倍） 野生蔓越莓活悦饮30 d，可明显降低血清及肝组织的脂质氧化产物丙二醛（MDA） 含量，升高血清、肝组织抗氧化产物还原型谷胱甘肽（GSH） 含量及血清、肝组织的超氧化物歧化酶（SOD） 活力，与对照组比较差异有显著性（p＜0.05）。根据 “关于印发抗氧化功能评价方法等9 个保健功能评价方法的通知” 中的判定标准，认为野生蔓越莓活悦饮具有抗氧化功能。

因受质量浓度及灌胃容积的限制，无法测得大鼠的LD50。大鼠灌胃最大灌胃量为936 mg/kg，相当于人体使用剂量2.06 mg/kg 的450 倍。根据以上几点，可以认为野生蔓越莓活悦饮毒性较小、安全。