青藤碱通过ANRIL/miR-626轴减轻MPP+诱导的SK-N-SH细胞损伤*

霍颖浩，王 进，殷立新

（河北医科大学第二医院 1神经内科，2药学部，河北石家庄050000）

帕金森病（Parkinson disease，PD）是中枢神经系统退行性疾病，主要表现为运动缓慢、震颤、感觉障碍等。PD 多发生于老年人群，随着社会老龄化的加剧，PD 发病率呈增长趋势［1］。目前，PD 的发病机制尚未阐明，已证实氧化应激、线粒体功能障碍、炎症等引起的细胞凋亡与PD 关系密切［2-3］。临床主要采用左旋多巴治疗PD，但长期疗效不佳，因此探究PD发病机制并寻找有效的治疗靶点十分重要。

青藤碱（sinomenine，SN）是中药青风藤的主要活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等多种药理学功效［4-5］。研究显示，SN可改善缺氧诱导的神经元形态，促进神经元存活，抑制神经元凋亡［6］。SN 可抑制氧糖剥夺诱导的大鼠海马神经元凋亡及乳酸脱氢酶的释放，减轻神经元的损伤［7］。长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸的小分子单链非编码RNA，可在转录、转录后、表观遗传等多个方面调控基因的表达，参与细胞生长、分化和凋亡等生命过程，与神经系统疾病的发生发展密切相关［8］。ANRIL 是近年来新发现的一种lncRNA。研究显示，ANRIL 在PD 患者体内差异性表达［9］。生物信息学软件预测显示，微小RNA-626（microRNA-626，miR-626）的靶基因可能是ANRIL。研究显示，miR-626 在PD 患者脑脊液中表达降低，可能是PD诊断和监测的新的生物标志物［10］。

本研究以人神经母细胞瘤SK-N-SH 细胞为研究对象，主要探讨SN对1-甲基-4-苯基吡啶（1-methyl-4-phenylpyridine，MPP+）诱导 SK-N-SH 细胞氧化应激及凋亡的影响，并以ANRIL/miR-626 为切入点，探讨SN 减轻MPP+所致SK-N-SH 细胞损伤的作用机制，以期为PD的治疗提供新思路。

材料和方法

1 细胞和实验试剂

人神经母细胞瘤SK-N-SH 细胞（中国科学院上海细胞库）。胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和RPMI-1640 培养基（Gibco）；胰蛋白酶（Sigma）；Trizol试剂和 LipofectamineTM2000 试剂盒（Invitrogen）；逆转录试剂盒和PCR 试剂盒（深圳晶美生物工程有限公司）；PCR 引物（上海生工生物工程有限公司）；膜联蛋白V（annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘 化 丙 啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡试剂盒（江苏凯基生物技术股份有限公司）；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；兔抗人Bcl-2 和Bax 多克隆抗体（Abcam）；双萤光素酶活性检测试剂盒（北京威格拉斯生物技术有限公司）；靶向ANRIL的小干扰RNA［ANRILsmall interfering RNA（siRNA），si-ANRIL］及乱序无意义阴性序列（negative control siRNA，si-NC），ANRIL过表达载体（pcDNA-ANRIL）及空载体（pcDNA），miR-626 模拟物（mimics）及阴性对照（上海吉凯基因公司）；丙二醛（malondialdehyde，MDA）和谷胱甘肽（glutathione，GSH）检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

2 实验方法

2.1 细胞培养 SK-N-SH 细胞用含10% FBS 的DMEM 培养基置于培养箱（37℃、5%CO2、97%湿度）中培养。每2～3 d 更换1 次新鲜的培养基。待细胞汇合至80%～90%时，吸弃培养基，加入适量预冷的PBS清洗细胞。吸弃PBS，加入0.25%胰蛋白酶溶液消化，进行传代培养。

2.2 细胞转染 将对数生长期的SK-N-SH 细胞以每孔1×105个接种于6 孔板中。待细胞汇合至60%时，分别将si-ANRIL、si-NC、pcDNA-ANRIL 及pcDNA转染至SK-N-SH 细胞，具体转染过程参照Lipo‑fectamineTM2000试剂盒说明书。转染后12 h，更换新鲜培养基，继续培养至48 h后，采用RT-qPCR检测细胞中ANRIL 水平以验证转染效果，并收集细胞用于后续实验。

2.3 细胞分组和处理 未转染的SK-N-SH 细胞分为对照（control，Con）组（细胞正常培养）、MPP+组（100 µmol/L［11］的 MPP+作用细胞 24 h）、MPP++SN-L组、MPP++SN-M 组和MPP++SN-H 组（浓度分别为5、10、20 µmol/L［6］的SN 与100 µmol/L 的MPP+共同作用细胞 24 h）。转染 si-ANRIL 和 si-NC 的 SK-N-SH 细胞均用 100 µmol/L 的 MPP+作用 24 h，分别记为 MPP++si-ANRIL 组和MPP++si-NC 组。转染pcDNA-ANRIL和 pcDNA 的 SK-N-SH 细胞均用 20 µmol/L 的 SN 与100 µmol/L 的 MPP+共同作用 24 h，分别记为 MPP++SN+pcDNA-ANRIL组和MPP++SN+pcDNA组。

2.4 流式细胞术检测细胞凋亡 未转染的SK-NSH 细胞及转染后的 SK-N-SH 细胞，以每孔 1×104个接种于24孔板中。细胞贴壁后，按照2.3分组处理，每组设置3 个复孔。培养后，收集细胞培养上清液，-20℃保存备用。胰蛋白酶消化细胞，PBS 清洗细胞2 次。取含1.0×106个细胞的细胞悬液，1 500 r/min离心5 min，加入400µL结合缓冲液重悬细胞。加入10 µL annexin V-FITC，室温避光孵育10 min。加入5µL PI，室温避光孵育5 min。再加入100µL结合缓冲液，混匀后，流式细胞仪检测细胞凋亡。

2.5 细胞培养上清液中MDA 和GSH 水平的检测将2.4 收集的细胞培养上清液3 500 r/min 离心10 min，分别参照MDA 和GSH 试剂盒说明书检测上清中MDA和GSH水平。

2.6 Western blot 法检测细胞中 Bax 和 Bcl-2 蛋白 的表达水平 RIPA 蛋白裂解液各组细胞，4℃、12 000 r/min 离心10 min，上清液即为总蛋白。BCA 法测定蛋白浓度。取适量蛋白溶液，100℃煮沸5 min。蛋白变性后，以每孔30 µg 蛋白行SDS-PAGE（5%浓缩胶，10%分离胶）。电泳后，将分离的蛋白条带湿转至聚偏二氟乙烯膜，并于5%脱脂牛奶中封闭2 h。分别加入抗Bax 和Bcl-2 抗体（1∶400 稀释），4℃孵育过夜。加入辣根过氧化酶标记的IgG（1∶200 稀释），37℃孵育1 h。加入ECL 化学发光试剂，避光显影后凝胶成像系统曝光拍照。以GAPDH 为内参照，ImageJ 软件分析目的蛋白条带灰度值。目的蛋白水平以其与GAPDH条带灰度值的比值表示。

2.7 RT-qPCR 检 测 细 胞 中 ANRIL 和 miR-626 的 表达水平 Trizol 试剂提取细胞中总RNA，微量核酸仪检测RNA 的纯度和浓度后，参照逆转录试剂盒说明书将RNA 逆转录为cDNA。然后以cDNA 为模板，进行扩增，反应总体系为20 µL，其中上、下游引物各0.5 µL。扩增程序为：95℃ 10 min；95℃ 5 s，60℃60 s，72℃ 30 s，35个循环。ANRIL 的上游引物序列为5'-TGAACGTGCCCGATGCTGG-3'，下游引物序列为 5'-CCGTGCCTTGAGCTAGCTC-3'；miR-626 的 上游引物序列为5'-GTGCGATCGTAAACCGTC-3'，下游引物序列为5'-CCGTGAAATGCTAGCTGA-3'；GAPDH 的上游引物序列为5'-TGAACGGGAAGCT‑CACTGG-3'，下游引物序列为5'-TCCACCACCCT‑GTTGCTGTA-3'；U6 的上游引物序列为5'-CTC‑GCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列为5'-AAC‑GCTTCACGAATTTGCGT-3'。ANRIL 以 GAPDH 为内参照，miR-626 以 U6 为内参照，采用 2-ΔΔCt法计算ANRIL和miR-626的相对表达水平。

2.8 双萤光素酶报告基因实验验证ANRIL 和miR-626 的靶向关系 生物信息学软件预测ANRIL 与miR-626 的结合片段。PCR 扩增含miR-626 结合位点的ANRIL 序列，并将其插入至pMIR-REPORT 中，构建ANRIL 野生型质粒（WT-ANRIL）；再利用基因突变技术将结合位点突变，构建ANRIL 突变型质粒（MUT-ANRIL）。分别将ANRIL-WT、ANRIL-MUT 与miR-626 mimic、阴性对照共转染至SK-N-SH 细胞。转染24 h 后，收集细胞。参照双萤光素酶活性检测试剂盒说明书，检测萤光素酶相对活性。

3 统计学处理

利用SPSS 22.0 软件分析实验数据。符合正态分布的计量资料以均数±标准差（mean±SD）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 SN对MPP+诱导SK-N-SH细胞氧化应激的影响

与control 组比较，MPP+组的MDA 水平升高（P＜0.05），GSH 水平降低（P＜0.05）；与 MPP+组比较，MPP++SN-L 组 、MPP++SN-M 组 和 MPP++SN-H 组 的MDA 水平降低（P＜0.05），GSH 水平升高（P＜0.05），且 MPP++SN-L 组、MPP++SN-M 组和 MPP++SN-H 组 3组间MDA 和GSH 水平的差异有统计学显著性（P＜0.05），见图1。

2 SN对MPP+诱导SK-N-SH细胞凋亡的影响

与control 组比较，MPP+组细胞的凋亡率和Bax蛋白水平升高（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平降低（P＜0.05）；与 MPP+组比较，MPP++SN-L 组、MPP++SN-M组和MPP++SN-H 组的细胞凋亡率和Bax 蛋白水平降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白水平升高（P＜0.05），且MPP++SN-L 组、MPP++SN-M 组和 MPP++SN-H 组 3 组间细胞凋亡率及Bax和Bcl-2蛋白水平的差异有统计学显著性（P＜0.05），见图2。

3 SN 对 MPP+诱 导 SK-N-SH 细 胞 中 ANRIL 和miR-626表达的影响

与control 组比较，MPP+组细胞中ANRIL 水平升高（P＜0.05），miR-626 水平降低（P＜0.05）；与MPP+组比较，MPP++SN-L 组、MPP++SN-M 组和 MPP++SNH 组的ANRIL 水平降低（P＜0.05），miR-626 水平升高（P＜0.05），且 MPP++SN-L 组、MPP++SN-M 组和MPP++SN-H 组 3 组间 ANRIL 和 miR-626 水平的差异有统计学显著性（P＜0.05），见图3。

4 ANRIL靶向调控miR-626的表达

Figure 1.The effect of SN on MPP+-induced oxidative stress in the SK-N-SH cells.The levels of MDA（A）and GSH（B）in the SKN-SH cell culture supernatants were detected.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs MPP+group；&P＜0.05 vs MPP++SN-L group；$P＜0.05 vs MPP++SN-M group.图1 SN对MPP+诱导的SK-N-SH细胞氧化应激的影响

Figure 2.The effect of SN on the apoptosis of the SK-N-SH cells induced by MPP+.A：the apoptotic rate of the SK-N-SH cells was de‑termined by flow cytometry；B：the protein expression of Bax and Bcl-2 in the SK-N-SH cells was detected by Western blot.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs MPP+ group；&P＜0.05 vs MPP++SN-L group；$P＜0.05 vs MPP++SN-M group.图2 SN对MPP+诱导的SK-N-SH细胞凋亡的影响

Figure 3.The effect of SN on the expression of ANRIL（A）and miR-626（B）in the SK-N-SH cells induced by MPP+.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；P＜0.05 vs MPP+group；&P＜0.05 vs MPP++SN-L group；$P＜0.05 vs MPP++SN-M group.图3 SN对MPP+诱导SK-N-SH细胞中ANRIL和miR-626表达的影响

由图4A 可见，生物信息学软件预测显示ANRIL序列中含有与miR-626 互补的核苷酸序列。双萤光素酶活性检测结果显示，miR-626 可降低WT-ANRIL的萤光素酶活性（P＜0.05），而对MUT-ANRIL 的萤光素酶活性无显著影响（P＜0.05），见图4B。与pcDNA组比较，pcDNA-ANRIL 组的 miR-626 水平降低（P＜0.05）；与 si-NC 组比较，si-ANRIL 组的 miR-626 水平升高（P＜0.05），见图4C。这些结果说明ANRIL 靶向负调控miR-626的表达。

Figure 4.ANRIL targeted miR-626 and regulated its expression.A：ANRIL contains the nucleotide sequences complementary to miR-626；B：the dual-luciferase reporter experiment results；C：ANRIL regulated miR-626 expression.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs miR-NC group；#P＜0.05 vs pcDNAgroup；&P＜0.05 vs si-NC group.图4 ANRIL靶向调控miR-626表达

5 敲减ANRIL 的表达对MPP+诱导SK-N-SH 细胞损伤的影响

MPP++si-ANRIL 组的 ANRIL 水平低于 MPP++si-NC组，miR-626水平高于MPP++si-NC组，见图5A、B。这表明si-ANRIL 在MPP+诱导的SK-N-SH 细胞中转染成功，细胞中ANRIL 表达受到抑制，而受ANRIL抑制的miR-626 表达水平升高。与MPP++si-NC 组比较，MPP++si-ANRIL 组的细胞凋亡率、Bax 蛋白水平和 MDA 水平降低（P＜0.05），Bcl-2 蛋白和GSH 水平升高（P＜0.05），见图5C～F。

Figure 5.The effect of ANRIL expression knock-down on MPP+-induced SK-N-SH cell injury.A：verification of the effect of ANRIL small interfering RNA（si-ANRIL）after transfection；B：miR-626 expression level in the SK-N-SH cells after transfection of si-ANRIL；C：the effect of ANRIL expression knock-down on the apoptotic rate of SK-N-SH cells induced by MPP+；D：the effect of ANRIL expression knock-down on the protein expression of Bax and Bcl-2 in the SK-N-SH cells induced by MPP+；E：the effect of ANRIL expression knock-down on MDA content in the culture supernatants of SK-N-SH cells in‑duced by MPP+；F：the effect of ANRIL expression knock-down on GSH content in the culture supernatants of SK-N-SH cells induced by MPP+.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs MPP++si-NC group.图5 敲减ANRIL表达对MPP+诱导SK-N-SH细胞损伤的影响

6 ANRIL 过表达逆转了SN 对MPP+诱导SK-N-SH细胞损伤的作用

MPP++SN+pcDNA-ANRIL 组 的 ANRIL 水 平 高 于MPP++SN+pcDNA 组，表明ANRIL过表达载体转染成功，细胞中ANRIL 过表达，见图6A。与MPP++SN+pcDNA 组比较，MPP++SN+pcDNA-ANRIL 组的细胞凋亡率、Bax蛋白表达和MDA 水平均升高（P＜0.05），miR-626 表达、Bcl-2 蛋白和 GSH 水平均降低（P＜0.05），见图6B～F。

讨 论

Figure 6.Over-expression of ANRIL reversed the effects of SN on MPP+-induced SK-N-SH cell injury.A：verification of the effect ofANRIL over-expression vector transfection；B：miR-626 expression level in the SK-N-SH cells after transfected with ANRIL over-expression vector；C：over-expression of ANRIL reversed the effect of SN on MPP+-induced SK-N-SH cell apoptosis；D：over-expression of ANRIL reversed the effect of SN on the protein expression of Bax and Bcl-2 in the SK-N-SH cells in‑duced by MPP+；E：over-expression of ANRIL reversed the effect of SN on MDA content in the culture supernatants of SK-NSH cells induced by MPP+；F：over-expression of ANRIL reversed the effect of SN on GSH content in the culture superna‑tants of SK-N-SH cells induced by MPP+.Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs MPP+group；#P＜0.05 vs MPP++SN+pcDNA group.图6 ANRIL过表达逆转了SN对MPP+诱导SK-N-SH细胞损伤的作用

PD 是多发生于老年人的神经系统退行性疾病，严重影响患者生活质量，给家庭和社会带来沉重的经济负担。氧化应激等引起的神经细胞凋亡与PD的发病机制密切相关［12-13］。MDA 是脂质过氧化产物之一，其水平高低可反映细胞氧化损伤程度［14］。GSH 是抗氧化剂，可增强机体抗氧化能力［15］。本研究显示MPP+诱导SK-N-SH 细胞后，细胞培养上清液中MDA 水平升高，GSH 水平降低，细胞凋亡率增加，与相关研究报道结果一致［16］，说明SK-N-SH 细胞在MPP+诱导后发生氧化应激和凋亡，细胞受损。与PD的病理过程有相似之处。

SN 是从中药青风藤中分离提纯获得的活性碱，在临床上主要用于治疗系膜增生性肾小球肾炎、类风湿性关节炎等疾病［17］。研究还显示SN 对脑出血、脑缺血、神经退行性疾病等多种中枢神经系统疾病模型具有神经保护作用［18］。但SN 在PD 中的作用及机制还未知。本研究显示，SN 可降低MPP+诱导的SK-N-SH 细胞上清液的MDA 水平，提高GSH 水平，说明SN 通过抑制MPP+诱导的SK-N-SH 细胞氧化应激减轻细胞损伤。细胞凋亡是细胞基本的生理过程，有助于维持细胞内稳态。Bcl-2 和Bax 在细胞凋亡过程中发挥重要作用，Bcl-2表达升高可抑制细胞凋亡，而Bax 表达升高则促进细胞凋亡。本研究显示，SN 可降低MPP+诱导的SK-N-SH 细胞凋亡率和Bax 蛋白表达，促进Bcl-2 蛋白表达，提示SN 通过调控Bcl-2 和Bax 蛋白表达抑制MPP+诱导的SK-N-SH细胞凋亡。

lncRNA 在神经系统疾病中发挥重要作用，可作为该类疾病的治疗靶点［19］。研究显示，抑制ANRIL基因表达可通过阻断核因子κB 信号传导途径减轻糖尿病大鼠视网膜病变［20］。本研究显示，MPP+诱导后，SK-N-SH 细胞中的ANRIL 表达水平升高，而SN可降低MPP+诱导的SK-N-SH 细胞中ANRIL 水平，提示ANRIL 可能参与神经细胞氧化应激的发生发展，是潜在的PD 治疗的作用靶点。通过转染si-ANRIL至SK-N-SH细胞敲减ANRIL表达后，MPP+诱导的SKN-SH细胞凋亡及细胞培养上清液中MDA水平降低，GSH 水平升高，说明敲减ANRIL表达可降低MPP+诱导的SK-N-SH 细胞氧化应激和凋亡。本研究还显示，ANRIL 过表达逆转了SN 对MPP+诱导SK-N-SH细胞凋亡及MDA 和GSH 表达的影响，提示SN 通过下调细胞中ANRIL 表达减轻MPP+诱导SK-N-SH 细胞损伤。

为了进一步探讨SN 通过下调ANRIL 表达减轻MPP+诱导的SK-N-SH细胞氧化应激和凋亡的作用机制，本研究应用生物信息学软件进行测试，结果显示miR-626 的靶基因可能是ANRIL。研究表明miR-626过表达可保护视网膜色素上皮细胞免受过氧化氢诱导的氧化损伤，抑制细胞凋亡［21］。目前，miR-626 对MPP+诱导的SK-N-SH细胞损伤的影响还不清楚。本研究通过双萤光素酶报告基因实验及RT-qPCR检测证实了ANRIL 在SK-N-SH 细胞中靶向负调控miR-626 表达，这也与 SN 降低 MPP+诱导的 SK-N-SH 细胞ANRIL 表达并促进miR-626 表达的结果一致，提示SN 可能通过下调细胞中ANRIL 表达进而上调miR-626 表达，从而抑制MPP+诱导的SK-N-SH 细胞氧化应激和凋亡。

综上所述，本研究从细胞层面进行的初步探讨结果提示SN 可抑制MPP+诱导的SK-N-SH 细胞氧化应激和凋亡，其机制可能是通过调控ANRIL/miR-626 通路发挥作用。了解上述病理变化可为探讨PD的发病机制提供参考。