α-酮酸检测方法的研究进展*

杨 阳，刘雪懿，焦淑玲，高文运

（1.西安医学院 药学院 药物研究所，陕西 西安710021；2.西北大学 生命科学学院国家微检测系统工程研究中心，陕西 西安 710069）

α-酮酸（Alpha-keto acid）是一种具有双官能团的生物活性物质，涉及生物代谢和机体多种生理病理过程，可作为有机合成和生物合成的中间体，广泛应用于医药、食品、化妆品等领域[1]。

近年来，α-酮酸在机体代谢调控和疾病诊断治疗方面的作用越来越受到重视。例如在肾病的防治方面，α-酮酸与低蛋白饮食搭配可以用于减缓慢性肾炎的发展进程，通过减少内源性尿素生成和炎症反应等措施，不仅降低了患者蛋白尿的排泄，而且提高了机体的抗氧化能力，有效缓解氧化自由基对细胞及机体的损伤，还改善了患者体内电解质紊乱现象，起到保护肾功能作用[2,3]。此外，丙酮酸（PA）具有增强心脏功能的作用，可以用于感染性休克的静脉复苏，也是心力衰竭的冠状动脉内输液和体外循环心脏停搏液中的一种成分，还能保护心脏免受因缺血再灌注或氧自由基暴露而造成的可逆性损伤（如昏迷）[4]。不仅如此，由于肿瘤细胞中糖酵解活性增强，使PA水平升高，故PA水平测定可作为口腔癌或其他恶性肿瘤的筛查工具[5]。在最新对PA的研究中，提出以PA为靶点的治疗策略可适用于多种组织癌症的治疗[6]。还有一类常见的α-酮酸是α-酮戊二酸（AKG），AKG能够调节机体的能量代谢，具有促进机体生长，维持肠道健康，改善骨质等多种生理功能[7]。α-酮酸还可用于氨基酸代谢先天缺陷疾病的诊断，如枫糖浆尿症（MSUD）、苯丙酮尿症（PKU）、高蛋氨酸血症、酪氨酸血症。

由于α-酮酸的上述作用，其检测方法对于疾病的诊断治疗，生物代谢过程研究具有重要意义。本文主要描述α-酮酸的各种检测方法在生物学研究和医药研究方面的应用，并阐述其优势、应用范围以及检测时需要注意的问题。

1 α-酮酸的检测方法

1.1 气相色谱-质谱联用

气相色谱-质谱联用（GC-MS）检测方法的选择性好，灵敏度高，但由于α-酮酸不具备挥发性，需要进行衍生化反应。最早使用的衍生化试剂为2,4-DNPH、五氟苯肼（pentafluorophenyl-hydrazine），所生成的衍生物会以顺反异构体形式存在不易被分离。而另一种试剂OPD形成的衍生化产物的挥发性差。为了解决上述问题，可以采用两步衍生化法。例如α-酮酸先与OPD生成喹喔啉类成分，再进行硅烷化，常用的硅烷化试剂是N，O-双（三甲基硅基）氟乙酰胺（BSTFA）（见图 1（1），Figure1（1））[8]。但由于硅的同位素会产生背景干扰，故选用不含硅元素的衍生化试剂替代，例如N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛（DMF-DAA）（见图 1（2））。后为了简化衍生步骤，Matsukawa等人[9]使用N-苯基-1,2苯二胺（NPhe-PDA）（见图2）作为衍生化试剂，产物1-苯基-3-甲基喹喔啉-2-酮（1-phenyl-3-methylquinoxalin-2-one）满足GC-MS的分离和检测条件。

图1 （1）喹喔啉与N，O-双（三甲基硅基）氟乙酰胺反应（2）喹喔啉与N,N-二甲基甲酰胺二甲基缩醛反应Fig.1 （1）Quinoxaline reacts with BSTFA（2）Quinoxaline reacts with DMF-DAA

图2 α-酮酸与N-苯基-1,2苯二胺反应Fig.2 α-keto acid reacts with N-Phe-PDA

此外，为了有效地避免硅同位素干扰，实现高灵敏度的检测[10]，Nguyen等人[11]采用气相色谱-质谱选择离子监测（SIM）模式对硅烷化的衍生物进行检测，该实验对衍生化条件进行优化，提高了α-酮酸衍生物的稳定性，并在质谱扫描和SIM两种模式下对衍生物进行分析，每个化合物的3个特征离子用于峰确认，而一个目标离子用于定量，得到了易被检测的特征离子，可以提高检测灵敏度，在一定程度上避免复杂样品（人的尿液、血浆和大鼠脑组织液）的基体干扰，实现了样品中17种酮酸的定性定量分析。

1.2 毛细管电泳

毛细管电泳（CE）是近30年来发展起来的新型分离技术[12]，是基于在电场中离子迁移速度的不同来实现各组分分离。由于苯丙酮酸具有电活性，CE与紫外检测器联用可实现生物样品中苯丙酮酸的分离检测[13]，从而对苯丙酮尿症进行无创诊断。CE还可与安培检测器联用测定苯丙酮尿症患者尿液中的苯丙酮酸和苯乙酸，实现了患者尿液中两种标志成分的同时测定[14]。此外，还可以对汗液中的丙酮酸进行分析，样品可不经预处理，具有分析速度快、操作简便等优点[15]。

1.3 高效液相色谱

高效液相色谱（HPLC）基于传统液相色谱采用高压输液系统，使样品中各成分实现高效快速的分离。不仅能够满足药物分析、疾病检测等方面α-酮酸的测定需求，也可应用于环境中α-酮酸的监测。通过联接不同的检测器，是现在对各种样品中α-酮酸进行检测的主流技术。

1.3.1 示差折光检测器 示差折光检测器（RID）是一种通用型检测器，是利用组分与流动相折射率之差对待测成分进行检测，对糖类和有机酸的检测灵敏度较高，该检测器可以用于发酵液中α-酮酸的检测。付永前等人[16]在检测米根霉富马酸发酵液中有机酸（如AKG）的实验中提到，之所以使用RID进行测定，是由于发酵液中的尿素、脂类等培养基成分在有机酸检测波长范围内均有较强的吸收，使用紫外检测器进行分析时易受到干扰，而培养基成分在RID中的出峰不影响对目标物质的检测。所建液相方法在AKG浓度0.05～10g·L-1范围内线性关系良好，r=0.9996，其检测限为 10mg·L-1。

1.5.2 荧光检测器 荧光检测器（FD）可用于检测能产生荧光或其衍生物能发荧光的物质，其灵敏度比紫外检测器要高，是对血浆、细胞类等生物样品中α-酮酸分析常用的检测器之一。使用FD对α-酮酸进行检测时，由于α-酮酸不能产生荧光，需要对其进行衍生化反应，能使α-酮酸产生荧光的试剂有OPD、1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯（1,2-diamino-4,5-methylenedioxy-benzene，DMB）（见图 3）、4'-肼基-2-二苯乙烯（4'-Hydrazino-2-stilbazole,4H2S）（见图4）等。其中最常使用的是OPD，它在2mol·L-1的盐酸中对α-酮酸进行衍生，在50℃下加热30min，所得衍生物荧光发射波长410nm，激发波长在350nm。所得含量测定结果批内、批间变异系数均小于10%，回收率在90%～110%之间[17]。这种衍生化试剂相较其他荧光衍生化试剂反应速度较快，而且对α-酮酸具有较好的选择性。但OPD对光敏感，易氧化，所以Fuchs等人[18]在使用OPD前要在100～120℃与正庚烷重新结晶，且OPD溶液要新鲜制备。

图3 α-酮酸与1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯反应Fig.3 α-keto acid reacts with DMB

图4 α-酮酸与4'-肼基-2-二苯乙烯反应Fig.4 α-keto acid reacts with 4H2S

1.5.3 紫外检测器 紫外检测器（UVD）是测定生物样品中α-酮酸常用的检测器，在使用这种检测器时，一般情况下会对α-酮酸进行衍生化，以便于得到分离度高、响应值强的分析图谱。例如在测定血浆中 α-酮戊二酸（AKG）时，选用 2,4-DNPH，2-硝基苯肼（2-NPH）作为衍生化试剂[19]。但二者所得衍生化产物均会以顺反异构体的形式存在,相比气相色谱，高效液相色谱分离效率更高，使衍生物的顺反异构体能得到较好的分离。但与2-NPH反应生成的异构体需在不同波长下检测，方法不够便捷。除这种衍生化试剂外，常用的衍生化试剂还有OPD，以及一些新型衍生化试剂，例如Khalida P.Mahar等人[20]使用1，2-二氨基-1，2-二苯乙烷（1,2-diamino-1,2-diphenylethane SDA）（见图5）进行柱前衍生，pH值为3.2和T=100℃条件下，反应30min，于255 nm处进行检测。Makahleh等人[21]也采用了新型衍生化试剂 2，4，6-三氯苯肼（2,4,6-trichloro phenyl hydrazine，TCPH）（见图6），并且对尿液样品预处理条件进行优化，可得到更加准确的检测结果。

图6 α-酮酸与2，4，6-三氯苯肼反应Fig.6 α-keto acid reacts with TCPH

还可以选择不经衍生化进行HPLC测定。例如果酒[22]、水果[23]等样品在测定PA或AKG时，通过向流动相加入缓冲盐或酸，并调节适宜pH值，选择合适的流速和柱温进行梯度洗脱，可以实现待测成分的分离。除此之外，还可以选择向流动相中加入离子对试剂进行分离。陶国庆等人[24]在测定细胞内AKG含量时，通过向流动相中加入离子对试剂四丁基氢氧化铵（TBAH），调节pH值为4，使待测的AKG成分与其他细胞代谢物得到较好分离，在214nm处进行测定。该方法线性方程相关系数高，AKG含量的相对标准偏差为0.38%,平均回收率达99.38%。此外，尿液等样品中复方α-酮酸片的有效成分也可不经衍生化实现测定，其中黄小雅等人[25]运用离子对色谱法对尿液中复方α-酮酸片的4种酮代氨基酸钙进行检测，选用乙腈、20mmol·L-1NaH2PO4缓冲液和15mmol·L-1TBAH为流动相，调pH值为7.0，在210nm处检测，经验证4种成分在20～200mg·L-1范围内线性关系良好，平均回收率在86.79%～112.00%。

在运用离子对色谱检测基础上，Zaifa等人[26]提出了样品前处理的优化对尿液中复方α-酮酸片的4种酮代氨基酸钙检测的重要性，他们对尿液进行三相中空纤维液相微萃取，这种纯化方法对有机溶剂的消耗较少，而且具有较高的富集作用，是一种环保、高效的样品制备方法。样品经处理后，减少了尿液中内源性物质的干扰，提高了检测的灵敏度。经验证四种α-酮酸类成分在0.1～10mg·L-1内均有较好线性关系，含量的相对标准偏差均小于6.27%，加标回收率在 92%～118%，检测限为 5.8～100.7μg·L-1，富集倍数在11～202之间。

1.5.4 质谱检测器 液相色谱与质谱联用在近些年在α-酮酸检测方面应用广泛，Francisco等人[27]采用HPLC-MS测定猪肉和伊比利火腿中α-酮酸的含量，进一步说明α-酮酸对发酵类食品香味的影响。在使用HPLC-MS测定生物样品中α-酮酸时，往往不需要衍生化，这样大大缩减了检测时间，而且避免了一些因衍生化而产生的干扰。这时液相方法的关键是色谱条件和质谱参数的选择。在Ruiting等人[28]所发表文献中，运用电喷雾电离正负离子测定，并且采用同位素标记内标物进行定量，消除因生物基体效应所造成的影响，提高检测的灵敏性。Zhang等人[29]在测定血清和肌肉中的支链酮酸时，选择用甲醇提取，能有效去除蛋白，并对提取液进行浓缩，采用高分辨质谱（HRMS）进行测定，提高了检测的灵敏度和准确性。

超高效液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）是在原有高效液相色谱的基础上，对仪器整体系统进行优化，使分析效率大大提高。例如细胞内的α-酮酸与苯肼（phenyl hydrazine）的衍生化产物，经UPLC分离后通过电喷雾质谱进行检测，使用同位素示踪法对其衍生物及衍生物异构体进行测定。这种检测技术相比传统的液相色谱-质谱联用，可实现更加高效、快速的分析。黄琪等人[30]使用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法（UPLC-Q-TOF-MS）可以同时测定生物样品中三羧酸循环中间体（如AKG）。其检测限低于60nM，回收率大于95%。

1.6 其他方法

除上述方法外，还有核磁共振技术、酶反应分析、电化学方法、传感器分析检测等方法也被用于检测α-酮酸。

1.6.1 核磁共振技术 J.E.A.等人[31]发表的文献中提到，NMR可用于啤酒中有机酸的定量，对啤酒中发现的6种主要酸（包括丙酮酸）进行了不同的核磁共振方法的比较。与传统的积分方法相比，偏最小二乘法（PLS）回归的使用使定量更快，并且研究了使用不同参考方法（毛细管电泳，直接和间接紫外检测，以及酶促分析）建立PLS模型的性能。核磁共振积分结果与PLS积分结果基本一致，这些结果使PLS-NMR方法成为啤酒中有机酸定量的一个有趣的选择。

1.6.2 酶反应分析 酶反应分析是通过酶促反应将α-酮酸转化为易被紫外检测的成分，进行定量分析。比如Theerasak等人[32]曾报道过的，用酶动学方法测定医疗产品和运动补充剂中的AKG，不需要比色探针或偶联反应就可以建立AKG含量测定的标准曲线，在20～160μM范围内具有良好的线性关系，检测限为4.09μM，定量限为13.62μM。这种方法具有检测快速，专属性好，不需要繁琐的样品处理，对环境无影响等优点，适用于质控实验室的AKG的常规分析。

1.6.3 电化学法 黄颖等人[33]将电化学法用于对羟基苯丙酮酸（pHPP）的检测，根据pHPP在碳纳米管修饰电极上的电化学行为进行分析，考察了多种因素对测定的影响。使用修饰电极通过差分脉冲伏安法进行测定，pHPP响应值较裸玻碳电极检测有明显的增强，经验证pHPP氧化峰电流强度与其浓度大小在 5×10-12～1×10-10mol·L-1范围内呈较好的线性关系，检测限为 1.36mol·L-1。

1.6.4 传感器技术 传感器技术是现在的一个研究热点，由于其分析方法简单、响应时间短、检测结果灵敏度高等特点，该技术可应用于PA的测定。检测PA的传感器种类有酶传感器[34,35]、比色传感器[36]、无酶传感器[37]。酶传感器检测的优点就是对待测成分专属性很强，这种检测器检测为避免干扰响应，会在丙酮酸氧化酶敏感电极上加上多离子络合双层体系[34]，或是采取更简便的措施，在探针上固着一层由丙酮酸氧化酶与戊二醛形成交联的不溶膜，然后在表面覆盖一层聚四氟乙烯膜[35]，这样既避免干扰，又降低成本。然后是比色传感器，这种传感器检测原理是由于PA可以使 C-rich DNA转换为i-基序DNA，从而失去保护金纳米粒子（AuNPS）免受盐诱导聚集效应的能力。通过加入丙酮酸脱羧酶（PDC）将PA转化为乙醛和CO2，使溶液pH值由酸性变为中性，C-rich DNA可以保持原有状态，并保护AuNPS免受盐诱导聚集效应。通过向样品加入PDC前后的吸光度差值可以定量PA，其检测限为3.0μM[36]。最近被用于该领域的是无酶传感器，这是一种用PA分子印迹聚合物（PA-IP）对碳糊电极（CPES）进行修饰的传感器，PA-IP不仅可以在电极表面富集PA，使目标化合物信号增强，而且能有效地与草酸、柠檬酸等干扰物质信号分离。这种传感器可在较宽浓度范围内和亚微摩尔水平上测定PA，检测限为0.1～200μM，并实现了血样和尿样中PA的测定[37]。

2 结论

α-酮酸作为糖、蛋白质、脂质代谢过程中的重要成分，在生物学研究方面，α-酮酸是生物代谢过程中的关键成分，一些α-酮酸在生物体内进入三羧酸循环，为生物体提供能量。通过对α-酮酸的含量分析，能够对生物代谢过程有更进一步的认识。在临床实践方面，由于α-酮酸与氨基酸的相互转化和一些疾病的产生密切相关，因此，通过对血液、尿液、组织液等生物样品中α-酮酸的含量测定，可以用于疾病诊断。在药物合成方面，因α-酮酸结构的特殊性，它可作为一些药物的合成中间体，所合成药物被用于治疗慢性肾病、恶性肿瘤、高血压等疾病。通过药物中α-酮酸的含量测定，可以对药物质量进行控制。综上所述，α-酮酸的检测方法对于生物学研究、临床实践等领域都有着非常重要作用。

近几十年现代分离分析方法的快速发展，使α-酮酸检测方法不断完善，从而加速了α-酮酸的研究进程。液质联用的应用范围较广，而且能得到精密准确的检测结果，是目前α-酮酸的主流检测手段。此外，一些正在研究开发的新技术在α-酮酸的检测中也取得了较好的结果，这些检测手段的持续发展将会有助于未来医药和生物学领域中α-酮酸的进一步研究。