齐墩果酸-苯甲醛缀合物的合成及抗肿瘤活性研究*

鲁 丹，蔡瑞雪,李雪枫,祝婷婷,方芙容,刘 斌,2

（1.陕西国际商贸学院 医药学院,陕西 西安 712046；2.陕西省中药绿色制造技术协同创新中心,陕西 西安 712046）

齐墩果酸（Oleanolic acid,OA,图1），又称土当归酸，是一种五环三萜类的天然产物，广泛分布在自然界的植物中，例如甘草、三七、丁香等[1-3]。齐墩果酸最初是作为护肝药物应用于临床，近年来发现其具有抗艾滋病、抗肿瘤，抗菌、预防骨质疏松症等多种生物活性[4-6]。更重要的是，齐墩果酸不仅来源丰富，而且毒性较低，因此，被认为是一个极具有前途的天然产物。然而，尽管齐墩果酸具有多种药理作用，但其自身药理作用仍然较弱，而且脂水分布系数不佳。这些缺点限制了齐墩果酸在临床上的广泛应用。因此，为了提高齐墩果酸的药理作用，研究人员对其做了大量的结构修饰[7-9]，其中最有效的方法之一就是将其他活性基团拼接到齐墩果酸上来得到活性更强得新型衍生物。例如，Cheng等[10]通过酯化反应将具有抗肿瘤活性的尿嘧啶药效团引入到齐墩果酸的C28位后，其抗肿瘤活性明显的提高了（化合物a,图1）。苯甲醛是有机合成的一个重要中间体，也是医药领域中一个重要的药效团，早在1995年就已经报道了苯甲醛及其衍生物具有良好的抗肿瘤活性[11]。因此，近年来，苯甲醛被修饰成了各种衍生物来发挥其生物活性。例如，刘进兵等[12]将苯甲醛修饰成磷酸酯（化合物b,图1）使其抗抑郁活性甚至强于上市药物丙咪嗪。基于齐墩果酸和苯甲醛所展现出的优秀活性，根据活性亚结构拼接原理，本文拟将这两个药效团通过酯化反应进行链接（图2），期望得到活性更强的齐墩果酸衍生物。随后，通过MTS法筛选了齐墩果酸与苯甲醛缀合物对肝癌HepG2细胞、乳腺癌MCF-7细胞、前列腺癌PC3细胞、人宫颈癌HeLa细胞的抗肿瘤活性。

图1 齐墩果酸及其衍生物和苯甲醛衍生物的化学结构Fig.1 Chemical structures of oleanolic acid and its derivatives,and benzaldehyde derivatives

图2 齐墩果酸-苯甲醛缀合物的合成路线Fig.2 Synthetic route of oleanolic acid-benzaldehyde conjugate

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

BrukerAM-400Hz型核磁共振仪（瑞士布鲁克公司）；MS-H-ProA磁力搅拌器（大龙兴创实验仪器（北京）股份公司）；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；ELx800型酶标仪（美国博腾仪器有限公司）。

齐墩果酸、对羟基苯甲醛、二甲氨基吡啶、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，分析纯，北京伊诺凯科技有限公司；其他试剂均为市售分析纯。

1.2 齐墩果酸-苯甲醛缀合物（2）的合成

Ar保护下，将 548mg（1.2mmol）齐墩果酸（1）、219mg（1.8mmol）对羟基苯甲醛溶解到20mL二氯甲烷中，冰浴下加入73mg（0.6mmol）二甲氨基吡啶（DMAP）和 1.151g（6.0mmol）1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，室温下反应24h，加入50mL 水，二氯甲烷萃取（3×15mL），合并有机层，用无水Na2SO4干燥，减压脱去溶剂，粗品用硅胶柱进行纯化（V石油醚/V乙酸乙酯=3/2），得到了 598mg白色固体，收率 88.9%。1H NMR（CDCl3，400MHz），δ:9.97（s，1H），7.90（d，2H，J=7.6Hz)，7.21（d，2H，J=8.0Hz），5.37（s，1H，H-12），2.96 （dd，1H，J=3.6Hz，J'=13.2Hz，H-18），2.50～2.61（m，1H），2.33～2.42（m，1H），2.07～2.15

（m，1H），1.65-1.98（m，10H），1.24～1.50（m，11H），1.19（s，3H，CH3），1.08（s，3H，CH3），1.04（s，6H，2 ×CH3），0.96 （s，3H，CH3），0.93 （s，3H，CH3），0.88（s，3H，CH3）。

1.3 抗肿瘤活性

取对数生长期的 HepG2、MCF-7、PC3、HeLa、MCF-10A细胞接种到96孔板中，每孔细胞密度为1×104个，在 5%CO237℃细胞培养箱中培养 12h，弃去培养基，加入 200μL 不同浓度（100，50，25，10，5，1，0.5，0.1，0.05，0μM）的缀合物 2和齐墩果酸（OA），细胞继续培养3d，每孔加入25μL MTS溶液，继续培养4h，在波长为490nM处用酶标仪测定每孔吸光度值（OD值），计算出化合物的IC50值。

2 结果与讨论

2.1 结构表征

通过1H NMR对目标缀合物2进行了结构表征，见图3。

缀合物2是由齐墩果酸骨架和苯甲醛单元构成，其中苯甲醛单元的质子信号出现在低场，在9.97×10-6有一个单峰，对应的是1个H，这是苯甲醛单元醛基的质子信号；此外，化学位移在7.9×10-6、7.2×10-6附近有两组双峰，每个化学位移对应的是2个H，其耦合常数J=8Hz左右，这是苯甲醛单元的苯环4个质子的信号；同时化学位移在5.37×10-6附近有一个单峰信号，其对应的是1个H，这是齐墩果酸骨架上C12位双键的质子信号；化学位移在2.99×10-6附近有两组d峰的信号，其对应的是1个H，这是齐墩果酸骨架上C18位的质子信号；另外，在化学位移在 0.8×10-6～1.2×10-6附近有六组单峰，5 个单峰的化学位移对应的是3个H，另外一个单峰对应6个H，这是齐墩果酸骨架上7个甲基的信号。

图3 齐墩果酸-苯甲醛缀合物的氢谱Fig.3 1H NMR of oleanolic acid-benzaldnyde conjugate

2.2 n DMAP∶n OA对缀合物（2）收率的影响

为了提高缀合物2的产率，我们探讨了缩合反应最佳反应条件。首先，对催化剂DMAP的物料比进行了探讨，以便筛出最佳的催化剂量，结果见表1。

表1 n DMAP∶n OA对缀合物（2）收率的影响Tab.1 Effect of n DMAP∶n OA on the yield of conjugate 2

由表 1 可见,在脱水剂 nEDC∶nOA=1∶1、反应时间为12h的条件下，不同物料比的DMAP对产率影响较大。当没有添加DMAP时（Entry 1），没有目标缀合物2的生成，这说明DMAP是该缩合反应的关键；当 nDMAP∶nOA由0∶1 增加到 0.5∶1 时（Entry 2～4），目标缀合物2的收率也不断增加，达到了63.4%；但是，进一步增加 DMAP的量（Entry 5～6），没有显著的提高收率。这表明，物料比nDMAP∶nOA为0.5∶1时为最佳催化量。

2.3 n EDC∶n OA对缀合物（2）收率的影响

在前面的催化剂DMAP筛选实验中，确定了其为最佳量。因此，接着也对脱水剂的物料比，即nEDC∶nOA也进行筛选，以便确定最佳的物料比，结果见表2。

表2 n EDC∶n OA对缀合物（2）收率的影响Tab.2 Effect of n EDC∶n OA on the yield of conjugate 2

结果表2的结果表明，当nEDC∶nOA从1∶1提高到5∶1时（Entry 1～3），缀合物 2的产率也由 63.4%不断的增加到68.9%，但是当nEDC∶nOA从5∶1再进行增加（10∶1,15∶1,Entry 4～5）时，缀合物 2 的产率并没增加。这表明nEDC∶nOA为5∶1是最佳的物料比。

2.4 反应时间对缀合物（2）收率的影响

最后，控制物料比 n(DMAP∶nEDC∶nOA为 0.5∶5∶1 的条件下，对反应时间进行研究，结果见表3。

表3 反应时间对缀合物（2）收率的影响Tab.3 Effect of reaction time on the yield of conjugate（2）

表3的结果表明，当反应时间为12h（Entry 1）时，缀合物2的收率为68.9%。但是，反应时间的增加后，缀合物2的收率也在增加（Entry 2～3）。当反应时间为24h时，缀合物2的收率达到了88.9%，而再增加反应时间却不能再提高缀合物2的收率（Entry 4～5）。因此，该缩合反应的最佳反应时间为24h。

2.2 抗肿瘤活性

为了评价齐墩果酸引入苯甲醛单元后是否提高了抗肿瘤活性，采用了MTS法测试了缀合物2的体外抗肿瘤活性，结果见表4。

表4 目标缀合物2的体外抗肿瘤活性（n=3）Tab.4 Anti-proliferative activity of conjugate 2（n=3）

表4结果表明，缀合物2对HepG2、MCF-7、PC3、HeLa这4种肿瘤细胞均展现出了抑制活性，并强于先导化合物齐墩果酸和苯甲醛，尤其是对MCF-7的抑制活性提高了近2倍。为了进一步探讨缀合物2的毒性，测试了其对正常的乳腺上皮细胞MCF-10A的抑制活性。表4的结果表明，缀合物2对正常的乳腺上皮细胞MCF-10A没有毒性。

3 结论

本文通过药物拼接原理，将齐墩果酸和苯甲醛通过酯化反应进行了偶联，并对酯化反应的条件进行了优化。结果表明，在物料比 nDMAP∶nEDC∶nOA=0.5∶5∶1、反应时间为24h的条件下，齐墩果酸与苯甲醛缀合物的产率最佳，为88.9%；通过生物活性测试表明，齐墩果酸与苯甲醛缀合物对HepG2、MCF-7、PC3和HeLa均有明显的抑制活性，并强于先导化合物齐墩果酸和苯甲醛；此外，缀合物对正常的MCF-10A细胞没有毒性。总的来说，我们的研究为今后天然产物齐墩果酸的结构修饰提供了一定的参考意义。