正交设计法优化胞磷胆碱钠合成工艺
2020-09-04孙立娜孙耀冉
孙立娜 孙耀冉
(1. 天津德亦诚医药咨询有限公司, 天津 300000; 2. 石家庄学院 化工学院, 河北 石家庄 050035)
胞磷胆碱钠是一种核苷衍生物,又名胞二磷胆碱钠,化学名为胆碱胞嘧啶核苷二磷酸酯单钠盐。是一种脑代谢激活剂,临床上主要用于急性颅脑外伤和脑手术后意识障碍,以及治疗帕金森综合征和神经性耳聋,也可用于其他中枢神经系统急性损伤引起的功能和意识障碍、缺血性脑血管病和血管性痴呆,对老年性痴呆症、抑郁症、延缓衰老和提高学习效果和记忆力等都有一定的疗效[1,2]。
关于胞磷胆碱钠制备方法的报导很多,但大致可归纳为三种途径。一种是有机化学合成法[3],该法存在产品难与缩合剂分离,不适合药用,反应转化率低,副产物多,成本高,环境污染严重等问题;一种是微生物发酵法,该法存在产物浓度低,产率不稳定等问题;还有一种是酶促合成法,如利用啤酒酵母泥等微生物进行生物合成[4,5]。采用游离的啤酒酵母泥细胞酶促合成,工艺简单、转化率高,成本低。通过酶促合成法合成胞磷胆碱钠的生产工艺过程可以分为酶促合成工艺和提取纯化工艺两大部分。本文通过正交设计法对酶促合成工艺中反应液组成的最佳条件进行了研究,即对反应液中胞苷酸、磷酸胆碱、葡萄糖、速冻啤酒酵母泥、硫酸镁的加入量进行优化,找到了反应底物的最佳配比。
1 材料与方法
1.1 试剂与仪器
胞苷酸、磷酸胆碱、葡萄糖和硫酸镁均为市售分析纯,酵母为啤酒生产中废弃的啤酒酵母泥,实验中使用的水均为自制的纯化水。
753BI型分光光度计;ZWF-6型三用紫外分析仪;DYY-8B型稳压稳流电泳仪;TGL-16G型高速离心机。
1.2 合成实验方法
啤酒酵母泥酶促合成胞磷胆碱钠的原理为胞二磷胆碱由微生物菌体所提供的酶系催化胞苷酸和磷酸胆碱而合成[6],国内使用啤酒生产中废弃的啤酒酵母泥,其中方程式为:
1.2.1 反应操作
根据正交试验方案设定组成方案,取适量胞苷酸、磷酸胆碱及葡萄糖分别置于锥形瓶中,加入纯化水,搅拌溶解后,加入速冻啤酒酵母泥,搅拌均匀,升温至29 ℃,加入定量的硫酸镁,搅拌均匀,开始计时。
维持反应温度30±1℃左右,反应2小时后取样,测转化率,补加葡萄糖,以补充代谢过程中所消耗的能量物质,加葡萄糖后搅拌均匀。以后每反应1.5小时补加一次葡萄糖,反应8小时后取样,测转化率。
1.2.2 后处理
反应结束后,加热升温至70±2 ℃保温10 min,迅速冷却至室温。将反应液进行板框压滤,得压滤液,滤渣干燥后可用做饲料。
1.3 含量测定方法
以胞苷酸投入量的转化率计算胞磷胆碱钠酶促反应合成的收率,30±1 ℃温度条件下反应,反应时间为约8小时,用琼脂糖电泳法和紫外分光光度法试验3次平均测定转化率[7]。
2 结果与讨论
2.1 正交设计实验方案
按照1.2中的实验方法在啤酒酵母泥酶催化下,以胞苷酸为起始底物进行胞磷胆碱钠的合成,该方法中所使用的主要原料有葡萄糖、磷酸胆碱、胞苷酸和硫酸镁,采用正交设计方法对四种主要原料的用量进行考察。根据大量单因素反应的结果,设定胞苷酸、葡萄糖、磷酸胆碱和硫酸镁四种反应底物的用量为四因素,每个因素三水平,如表1所示。
表1 因素水平表
注:底物浓度以100 mL反应液为准
2.2 试验结果
设定反应液总量为100 mL,按照表1中各组分的量加入底物,按照1.2中的实验方法在啤酒酵母泥酶催化下,采用L9(34)正交设计法进行设计实验,以胞苷酸的转化率作为考察指标,正交设计的具体方案和实验结果如表2所示,方差分析结果见表3。
表2 正交试验设计方案及结果
表3 方差分析结果
从表2的实验结果可以看出,A因素即胞苷酸用量的各水平极差最大,为41.1,其为最主要影响因素,A2为A因素优先水平。胞苷酸作为主要原料之一,当浓度适当增加时,增大了反应物的浓度扩散动力,有助于增大转化率。但是当增加过多后,过量的胞苷酸会激活胞苷酸水解酶,胞苷酸被水解为胞苷,胞磷胆碱钠产率下降,同时,大量副产物胞苷会给反应后的分离提纯带来困难[8]。从表2的实验结果还可以看出,B因素极差为14.9,影响次之,B2为B因素优先因素,C因素、D因素影响相近,以C3、D1最佳。
根据葡萄糖、磷酸胆碱、胞苷酸、硫酸镁四因素筛选试验结果和表3中方差分析的结果可以看出,A(胞苷酸的用量)为显著影响因素,而B、C、D的实验结果影响不显著。因此在合成工艺中应该严格控制胞苷酸的用量。在A2B2C3D1组合下反应,胞磷胆碱钠产率较高。根据以上结论,以100 mL反应液为准,确定底物浓度的最佳组成方案为:葡萄糖30 g,磷酸胆碱7.0 mL,胞苷酸1.0 g,硫酸镁0.5 g。
3 结论
在啤酒酵母泥酶催化下,以胞苷酸为起始底物合成胞磷胆碱钠,该路线中所使用的主要原料有葡萄糖、磷酸胆碱、胞苷酸和硫酸镁,采用L9(34)正交设计法进行设计实验,以胞苷酸的转化率作为考察指标,对工艺中四种主要原料的用量进行优化。根据正交实验的结果,得出以100 mL反应液为准的底物浓度的最佳组合方案为:葡萄糖30 g,磷酸胆碱7.0 mL,胞苷酸1.0 g,硫酸镁0.5 g。
此外啤酒酵母泥酶催化反应的初始pH、反应温度和时间有待进一步考察,以最终得到啤酒酵母泥酶催化下,以胞苷酸为起始底物合成胞磷胆碱钠的总工艺。