黄精多糖对TNF-α作用的大鼠成骨细胞增殖、凋亡影响及其机制研究

刘超 徐飞 吴涛 王子平 赵晓明

1.汉中市三二O一医院急诊科，陕西 汉中 723000

2.汉中市三二O一医院急诊科，陕西 汉中 723000

3.略阳县人民医院骨科，陕西 汉中 724300

4.宝鸡市中心医院骨科，陕西 宝鸡 721008

骨质疏松症的主要病理特征为骨量减少及骨微结构退化，成骨细胞是一种功能性细胞并可在骨形成过程中发挥重要作用[1-2]。研究[3]表明中医药治疗具有补肾健脾及活血等功能，对骨质疏松症具有一定治疗效果。研究[4-5]发现，黄精多糖(polygonatum sibiricum polysaccharide，PSP)具有抗骨质疏松的作用并可有效改善骨微结构。PSP可促进骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化[6]。研究报道[7]指出补肾方可能通过上调微小RNA-212(micro RNA-212，miR-212)表达进而有效治疗骨质疏松。然而，PSP是否通过上调miR-212的表达治疗骨质疏松尚未可知。因此，本研究通过应用肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为诱导成骨细胞凋亡的介质，探讨黄精多糖是否可通过调控miR-212表达从而影响TNF-α诱导的大鼠成骨细胞增殖及凋亡，以期从分子水平探讨黄精多糖防治骨质疏松症的作用，为临床合理用药提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大鼠成骨细胞 CP-R091购自武汉普诺赛生命科技有限公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)购自苏州赛业生物科技有限公司；黄精多糖购自陕西慈缘生物技术有限公司；α-MEM培养基购自南京维森特生物技术有限公司；胎牛血清(FBS)购自美国Sigma公司；噻唑蓝(MTT)购自江苏凯基生物技术股份有限公司；反转录试剂盒与Realtime PCR SYBR premix均购自日本TaKaRa公司；Trizol试剂与Lipofectamine 2000转染试剂均购自美国Invitrogen公司；miR-212 mimics、miR-212抑制剂(anti-miR-212)及其阴性对照均购自广州锐博生物科技有限公司；兔抗鼠Cyclin D1、P21、BcL-2、Bax一抗与辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗均购自美国Cell Signaling Technology公司；蛋白裂解液与BCA检测试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；显色液购自美国BIO-BAD公司；细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1成骨细胞CP-R091培养及黄精多糖处理：CP-R091细胞培养于含有10 %FBS的α-MEM培养基内，置于37 ℃、5 % CO2体积分数培养箱内培养，收集对数生长期细胞，加入完全培养基重悬细胞，接种于96孔细胞培养板，待细胞生长融合度达到70 %时，使用不同浓度的黄精多糖处理细胞：5、10、25、50 mg/L[8]，同时将未经处理的CP-R091细胞作为对照即CP-R091组。

1.2.2TNF-α处理及实验分组：收集黄精多糖处理24 h后的CP-R091细胞，每组分别加入浓度为30 μg/L的TNF-α进行处理48 h[9]，实验分组分别为CP-R091+TNF-α组、CP-R091+TNF-α+PSP 5 mg/L组、CP-R091+TNF-α+PSP 10 mg/L组、CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L组、CP-R091+TNF-α+PSP 50 mg/L组，根据MTT实验检测结果选取黄精多糖适宜浓度进行后续实验。后续研究中为验证黄精多糖是否可通过调控miR-212表达进而影响成骨细胞增殖及凋亡，将miR-212 mimics及其阴性对照分别转染入CP-R091细胞(12 h)，并加入TNF-α进行诱导48 h，分别为miR-212组、miR-NC组；将anti-miR-212、anti-miR-NC分别转染入CP-R091细胞(12 h)，加入TNF-α进行诱导48 h，加入适宜浓度的黄精多糖处理24 h，分别为CP-R091+TNF-α+ PSP 25 mg/L+anti-miR-212组、CP-R091+TNF-α+ PSP 25 mg/L+anti-miR-NC组，收集各组对数生长期细胞进行后续实验。

1.2.3MTT检测细胞增殖：收集各组对数生长期CP-R091细胞，分别于药物处理或实验处理24、48、72 h时，向每孔加入20 μL浓度为5×103mg/L的MTT溶液，室温孵育4 h，弃上清，每孔分别加入150 μL二甲基亚砜(DMSO)，放入摇床内振荡培养15 min，利用酶标仪检测波长490 nm处各孔光密度值(OD)，每组实验均设置3次重复。

1.2.4流式细胞术检测细胞凋亡：收集实验处理后各组CP-R091细胞，胰蛋白酶消化细胞，4 ℃ 12 000 r/min转速离心5 min，收集细胞，用PBS洗涤细胞，加入100 μL Binding Buffer制备细胞悬液，相同离心条件下进行离心，加入加入5 μL 膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)，充分混匀后加入10 μL碘化丙锭(PI)染色液，室温下避光孵育15 min，加入400 μL Binding Buffer，每个样本分别收集1×104个细胞，利用流式细胞仪上机检测计算细胞凋亡率。

1.2.5qRT-PCR检测细胞中miR-212相对表达量：采用Trizol法提取各组CP-R091细胞RNA，应用核酸蛋白分析仪检测RNA浓度与纯度，参照反转录试剂盒合成cDNA，每组均设置3个复孔，根据qRT-PCR反应试剂盒配置20 μL反应体系，反应条件为95 ℃预变性 2 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40次循环。miR-212以U6为内参基因，反应结束后，采用 2-ΔΔCt法计算miR-212相对表达量。

1.2.6蛋白免疫印迹(Western blot)检测Cyclin D1、P21、BcL-2、Bax蛋白表达：收集各组CP-R091细胞，加入蛋白裂解液提取CP-R091细胞总蛋白，采用BCA法进行蛋白定量，取蛋白样本20 μg进行SDS-PAGE凝胶电泳反应，将分离的蛋白凝胶转移至PVDF膜，室温条件下放入室温封闭液封闭1 h，TBST清洗3次×5 min，加入一抗(稀释比1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，TBST清洗3次×5 min，加入二抗(稀释比1∶3 000)，室温下振荡孵育1 h，TBST清洗3次×5 min，加入显色液，置于凝胶成像仪内显影，调整曝光时间，应用Quantityone软件分析条带灰度值，蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参照条带灰度值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091增殖影响

黄精多糖作用TNF-α诱导的成骨细胞CP-R091 48 h后，细胞增殖检测结果为：与CP-R091组比较，CP-R091+TNF-α组CP-R091细胞增殖活性显著降低(P<0.05)，Cyclin D1蛋白表达显著降低(P<0.05)，而P21蛋白表达显著升高(P<0.05)；与CP-R091+TNF-α组比较，CP-R091+TNF-α+PSP 10 mg/L组、CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L组、CP-R091+TNF-α+PSP 50 mg/L组CP-R091细胞增殖活性显著升高(P<0.05)，Cyclin D1蛋白表达显著升高(P<0.05)，而P21蛋白表达显著降低(P<0.05)，但CP-R091+TNF-α组与CP-R091+TNF-α+PSP 5 mg/L组间比较差异不显著(P>0.05)，CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L组、CP-R091+TNF-α+PSP 50 mg/L组间比较差异不显著(P>0.05)，因此选取黄精多糖浓度为25 mg/L进行后续研究，见图1。

2.2 黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091凋亡影响

实验结果显示(图2)，同CP-R091组相比，CP-R091+TNF-α组成骨细胞凋亡率显著增加(P<0.05)，BcL-2蛋白水平明显下降(P<0.05)，而Bax蛋白水平明显上升(P<0.05)；相较于CP-R091+TNF-α组，CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L组成骨细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，BcL-2蛋白水平明显升高(P<0.05)，而Bax蛋白水平明显降低(P<0.05)。

2.3 黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091中miR-212表达的影响

实验结果显示(图3)，TNF-α诱导的CP-R091细胞中miR-212的表达水平较正常培养的CP-R091细胞显著降低(P<0.05)，而CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L组CP-R091细胞中miR-212的表达水平与CP-R091+TNF-α组相比显著升高(P<0.05)，见表3。

2.4 过表达miR-212表达对TNF-α处理的细胞CP-R091增殖、凋亡的影响

qRT-PCR法检测CP-R091细胞中转染miR-212 mimics的转染效果，结果显示，与miR-NC组相比，miR-212组CP-R091细胞中miR-212的表达水平显著升高(P<0.05)，见图4 A。表明成功上调TNF-α处理的细胞CP-R091中miR-212的表达水平。实验结果显示(图4)，同miR-NC组相比，miR-212组CP-R091细胞增殖活性显著升高(P<0.05)，细胞凋亡率显著降低(P<0.05)，Cyclin D1、BcL-2蛋白水平显著升高(P<0.05)，而Bax、P21蛋白水平显著降低(P<0.05)。

图1 黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091增殖蛋白影响A：黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091存活率的影响；B、C：黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091增殖蛋白表达的影响。注：与CP-R091组比较，aP<0.05；与CP-R091+TNF-α组比较，bP<0.05；与CP-R091+TNF-α+PSP 5 mg/L组比较，cP<0.05；与CP-R091+TNF-α+PSP 10 mg/L组比较，dP<0.05；与CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L组比较，eP<0.05。Fig.1 Effect of Polygonatum Polysaccharide on the Expression of Proliferating of CP-R091 in Cells Induced by TNF-α

图2 黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091凋亡的影响 A、B：黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091凋亡的影响；C：黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091凋亡蛋白表达的影响；D：Western blot法检测BcL-2、Bax蛋白表达。注：与CP-R091组比较，aP<0.05；与CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L组比较，bP<0.05。Fig.2 Effect of Polygonatum Polysaccharide on Apoptosis of CP-R091 Cells induced by TNF-α

图3 黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091中miR-212表达的影响注：与CP-R091组比较，aP<0.05；与CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L组比较，bP<0.05。Fig.3 The effect of polygonatum sibiricum polysaccharide on the expression of miR-212 in CP-R091 cells treated with TNF-α

图4 过表达miR-212对TNF-α处理的细胞CP-R091增殖、凋亡的影响 A：miR-212的表达；B：过表达miR-212对TNF-α处理的细胞CP-R091存活率的影响；C：过表达miR-212对TNF-α处理的细胞CP-R091凋亡的影响；D、E：过表达miR-212对TNF-α处理的细胞CP-R091增殖、凋亡蛋白表达的影响。注：与miR-NC组比较，aP<0.05。Fig.4 Effect of overexpression of miR-212 expression on proliferation and expression of apoptosis protein in TNF-α-treated cells

2.5 抑制miR-212能逆转黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091增殖的促进作用

黄精多糖是否通过上调miR-212表达而发挥作用，实现结果显示，与CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L+anti-miR-NC组相比，CP-R091+TNF-α+PSP 25 mg/L+anti-miR-2 12组CP-R091细胞增殖能力显著降低(P<0.05)，Cyclin D1蛋白水平显著降低(P<0.05)，而P21蛋白水平显著升高(P<0.05)，见图5。

图5 抑制miR-212能逆转黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091增殖的影响 A：抑制miR-212能逆转黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091存活率的影响；B、C：抑制miR-212能逆转黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091增殖蛋白表达的影响。注：与CP-R091+TNF-α组比较，aP<0.05；与CP-R091+TNF-α+ PSP 25 mg/L+anti-miR-NC组比较，bP<0.05。Fig.5 Inhibition of miR-212 can reverse the expression of proliferating of CP-R091 in the cells affected by TNF-α

2.6 抑制miR-212能逆转黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091凋亡的抑制作用

实验结果显示(图6)，CP-R091+TNF-α+ PSP 25 mg/L+anti-miR-212组CP-R091细胞凋亡率较CP-R091+TNF-α+ PSP 25 mg/L+anti-miR-NC组显著升高(P<0.05)，Bax蛋白水平显著升高(P<0.05)，而BcL-2蛋白水平显著降低(P<0.05)。

图6 抑制miR-212能逆转黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091凋亡表达的影响 A：miR-212的表达；B：抑制miR-212能逆转黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091凋亡的影响；C、D：抑制miR-212能逆转黄精多糖对TNF-α作用的细胞CP-R091凋亡蛋白表达的影响。注：与CP-R091+TNF-α组比较，aP<0.05；与CP-R091+TNF-α+ PSP 25 mg/L+anti-miR-NC组比较，bP<0.05。Fig.6 Inhibition of miR-212 can reverse the effect of Polygonatum polysaccharides on the apoptosis expression of CP-R091 in cells treated with TNF-α

3 讨论

黄精多糖可有效降低血糖血脂且具有抗炎、抗病毒等多种作用功能作用[10]。研究报道[11-12]指出黄精多糖可有效治疗动脉粥样硬化、糖尿病等多种疾病。黄精多糖可促进骨髓间充质干细胞骨向分化过程[13-14]。以上研究结果提示黄精多糖可能成为治疗骨质疏松症的新型药物。本研究结果显示，TNF-α诱导的成骨细胞增殖能力明显降低，而细胞凋亡能力明显升高，使用不同剂量的黄精多糖能够显著促进成骨细胞增殖并抑制细胞凋亡，说明黄精多糖可能通过调控细胞增殖及凋亡相关蛋白表达进而促进成骨细胞增殖并抑制其凋亡。P21属于负向周期调控蛋白并可抑制细胞增殖，Cyclin D1属于正向周期调控蛋白并可促进细胞增殖[15]。本研究结果表明黄精多糖可显著上调Cyclin D1表达及下调P21表达而促进细胞周期由G1期进入S期进而促进成骨细胞增殖，提示促进成骨细胞增殖可能是黄精多糖发挥抗骨质疏松作用的潜在分子机制。BcL-2家族相关基因表达可调控细胞凋亡过程，BcL-2基因是抗凋亡基因并可通过阻止细胞色素C释放进而抑制细胞凋亡，而Bax是促凋亡基因并可通过激活Caspase-3级联反应继而促进细胞凋亡，已有研究[16]表明BcL-2过表达可明显抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡。本研究结果提示黄精多糖可明显抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡。

miR-212可通过抑制靶基因ZNF133表达进而抑制骨肉瘤细胞增殖及迁移[17]。Liu等[18]研究表明miR-212-3p表达异常与骨关节炎等发生及发展密切相关。本研究结果显示TNF-α诱导的成骨细胞中miR-212的表达水平显著降低，而使用黄精多糖处理后可明显上调miR-212的表达水平，说明黄精多糖可能通过上调miR-212表达而发挥作用。同时本研究结果发现TNF-α诱导的成骨细胞中上调miR-212表达可显著促进成骨细胞增殖并降低细胞凋亡水平，Cyclin D1、BcL-2蛋白表达升高，而Bax、P21蛋白表达降低，为进一步证实黄精多糖对TNF-α诱导的成骨细胞增殖及凋亡的影响是否与调控miR-212表达有关，本研究通过抑制miR-212表达发现其可明显逆转黄精多糖对TNF-α诱导的成骨细胞增殖的抑制作用及其对细胞凋亡的促进作用，并可逆转其对Cyclin D1、BcL-2、Bax、P21蛋白表达的作用。提示黄精多糖可能通过上调miR-212表达进而促进成骨细胞增殖及抑制细胞凋亡进而减缓骨质疏松症进展。

综上所述，黄精多糖可能通过上调miR-212表达而明显抑制TNF-α诱导的成骨细胞凋亡并促进细胞增殖，其可能通过调控细胞增殖及凋亡相关蛋白表达而保护成骨细胞，为黄精多糖治疗骨质疏松症奠定理论基础。但关于黄精多糖对TNF-α诱导的成骨细胞相关信号通路及miR-212下游靶基因的调控作用仍需进一步探讨。