人工虎骨粉对去卵巢大鼠骨组织中Sirt1/Runx2信号通路的影响

邹毅 冷华伟 桂鹏 张均泉 张玉峰 王奎 王明辉 叶茂

中国贵航集团三O二医院骨科，贵州 安顺 561000

骨质疏松症是一种以骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加及临床表现为骨折危险性增加的骨代谢性疾病，报道[1-2]显示其具有较高的发病率，涉及人群较广，以绝经后女性多见。对骨质疏松症的防治已成为国内外学者探讨和研究的热点话题。目前西药治疗骨质疏松症取得了一定的效果，但是不良反应较多，不宜长期使用[3-4]。因此，对于中医药防治骨质疏松症的研究需进一步的深入探讨。

人工虎骨粉为新一代的虎骨替代品，含有丰富的骨胶原、骨肽、成骨元素和骨形成所必需的的钙、磷，以及微量元素锶、镁、锌、铜、锰等，现代医学已证实其具有显著的抗炎、镇痛及抗骨质疏松作用[5]，但其作用机制仍不是很明确。本研究主要探讨人工虎骨粉对去卵巢大鼠骨组织中Sirt1/Runx2信号通路的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1实验动物：8月龄健康雌性SD大鼠，体重260～310 g，SPF级，分笼饲养，自由进食。饲养环境：相对湿度55%，温度22 ℃，12 h明暗周期。实验符合美国国立卫生研究院实验动物护理和使用指南。

1.1.2主要试剂与仪器：人工虎骨粉(国药准字Z20030079)购自金花企业西安金花制药厂；大鼠骨钙素 ELISA 检测试剂盒(ml002883)、大鼠抗酒石酸酸性磷酸酶ELISA检测试剂盒(SBJ-R0426)购自上海酶联生物科技有限公司；戊巴比妥钠购自武汉易泰科技有限公司上海分公司；Sirt1抗体(ab12193)、Runx2抗体(ab76956)、Foxo1抗体(ab52857)、Foxo3a(ab12162)购自艾博抗(上海)贸易有限公司；InAlyzer小型动物双能X射线仪购自深圳柏安诺科技有限公司；JIDi-17R微量高速冷冻离心机购自广州吉迪仪器有限公司；PUZS-600 A全自动生化分析仪购自北京普朗新技术有限公司；HY-0580骨科生物力学试验机购自上海衡翼精密仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1建立去卵巢大鼠模型：按照4 mL/kg的剂量腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉大鼠，仰卧位固定大鼠，在腰椎沿背部正中线向下做一约2 cm的纵形切口，依次切开皮肤、筋膜与肌肉组织，以手线结扎输卵管及其周围血管，然后将双侧卵巢切除。将腹膜与肌肉一起缝一针，确认无出血后缝合皮肤。

1.2.2实验分组：选取60只SD大鼠，随机分为去卵巢组、人工虎骨粉组、假手术组3组，每组20只。人工虎骨粉组建立去卵巢大鼠模型，切除卵巢2周后灌胃给予0.24 g/(kg·d)的人工虎骨粉；去卵巢组建立去卵巢大鼠模型，切除卵巢2周后灌胃给予等效剂量的生理盐水；假手术组仅切除卵巢周围脂肪组织，不切除双侧卵巢，切除卵巢周围脂肪组织2周后灌胃给予等效剂量的生理盐水。连续给药12周。实验过程中将大鼠分笼饲养，自由进食。饲养环境：相对湿度55%，温度22 ℃，12 h明暗周期。3组大鼠体重比较无统计学差异，饲养条件一致。

1.2.3检测指标：给药12周后，用1%戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉，腹主动脉采血，置入抗凝管后，4 ℃,3 000 r/min,离心20 min，取血清，保存于-80 ℃备用。采集血样后处死大鼠，分离左侧股骨，清除肌肉组织与结缔组织后称重量，一部分固定于多聚甲醛中用于组织学分析，另一部分以生理盐水浸泡的纱布包裹股骨，保存于-80 ℃环境中用于骨密度、生物力学分析与Western Blot检测。

1.2.4骨密度检测：常温静置解冻股骨标本，采用双能X射线仪检测骨密度。

1.2.5骨代谢检测：常温静置解冻血清标本，置于离心机内3 000 r/min离心10 min，利用酶联免疫吸附法检测骨钙素、抗酒石酸酸性磷酸酶浓度，严格按照试剂盒说明书操作；利用全自动生化分析仪检测钙、碱性磷酸酶、磷浓度。

1.2.6组织学观察：股骨标本置于多聚甲醛中固定48 h后，以8%EDTA脱钙液脱钙2周，石蜡包埋，10 μm厚度连续切片，利用电吹风融化切片上的石蜡，常规苏木精-伊红染色，中性树脂封固后显微镜下观察。

1.2.7骨生物力学：常温静置解冻股骨标本，在材料试验机上进行三点弯实验，检测股骨的最大载荷、断裂载荷、最大应力、弹性模量等指标，样本跨度为20 mm，为减小测量误差，设置所有股骨标本的放置角度、方向与距离一致，设置加载速度为1 mm/min，垂直于股骨干纵轴方向进进行加载，直至股骨断裂。

1.2.8Western Blot检测：常温静置解冻股骨标本，利用Western Blot检测 Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表达。取股骨组织，加入蛋白裂解液4 ℃研磨匀浆，12 000 r/min离心15 min后吸取上清，利用BCA法检测蛋白浓度。取50 μg蛋白样品→加入6 μL5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液充分混合均匀→100 ℃水浴加热3 min变性蛋白→制备分离胶与浓缩胶→点样、电泳→转膜→洗膜→封闭→孵育一抗(37 ℃,1.5 h)→洗膜→孵育二抗(37 ℃,1.5 h)→洗膜→化学发光底物(避光反应5 min)→暗室曝光→显影→定影→图像分析。

1.3 统计学处理

利用统计学软件22.0进行统计学处理，计量数据以均数±标准差为表达格式，采用单因素方差分析结果，以P<0.05判定为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 骨密度

去卵巢组大鼠股骨骨密度低于假手术组，差异具有统计学意义(P<0.05)；人工虎骨粉组大鼠股骨骨密度高于去卵巢组，差异具有统计学意义(P<0.05)，见图1。

2.2 骨代谢

与假手术组比较，去卵巢组骨钙素、抗酒石酸酸性磷酸酶、血钙、血磷及碱性磷酸酶浓度均明显升高，差异具有统计学意义(P<0.05)；与去卵巢组比较，人工虎骨粉组骨钙素、抗酒石酸酸性磷酸酶、血钙、血磷及碱性磷酸酶浓度均明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图1 各组大鼠股骨骨密度注：与去卵巢组比较，*P<0.05。Fig.1 Bone mineral density of femur in rats in each group

表1 各组大鼠骨代谢指标 (n=20)Table 1 Bone metabolic indices of rats in each group (n=20)

2.3 组织学观察

苏木精-伊红染色显示，假手术组大鼠骨密质较厚且均匀，骨细胞排列整齐，骨小粱结构紧密且连续性好，钙盐沉积均匀；去卵巢组大鼠骨密质较假手术组薄，骨细胞变少且排列紊乱，骨小梁稀疏、纤细、大片断裂，钙盐沉积明显减少，髓腔相对扩大；与去卵巢组比较，人工虎骨粉组大鼠骨密质明显增厚，骨小梁变粗、变密，横向联接增加。见图2。

2.4 骨生物力学

与假手术组比较，去卵巢组最大载荷、断裂载荷、最大应力、弹性模量显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)；与去卵巢组比较，人工虎骨粉组最大载荷、断裂载荷、最大应力、弹性模量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。

图2 各组大鼠股骨组织学观察(苏木精-伊红染色，×200)Fig.2 Histological observation of femur in rats of each group (hematoxylin-eosin staining,×200)

表2 各组大鼠股骨生物力学 (n=20)Table 2 Femoral biomechanics of rats in each group(n=20)

2.5 Western Blot检测

与假手术组比较，去卵巢组股骨组织 Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表达降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；与去卵巢组比较，人工虎骨粉组股骨组织 Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表达升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。见图3。

图3 各组大鼠股骨组织Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表达 (n=20)注：A：各组股骨组织内Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表达Western Blot检测条带；B：各组股骨组织内Sirt1蛋白半定量分析结果；C：各组股骨组织内Runx2蛋白半定量分析结果；D：各组股骨组织内Foxo1蛋白半定量分析结果；E：各组股骨组织内Foxo3a蛋白半定量分析结果。与去卵巢组比较，*P<0.05。Fig.3 The expressions of Sirt1,Runx2,Foxo1 and Foxo3a in femoral tissues of rats in each group (n=20)

3 讨论

人工虎骨粉具有抗骨质疏松作用。何保玉等[6]对160例原发性骨质疏松症患者分别进行口服金天格胶囊(观察组)与钙尔奇D3片治疗(对照组)，发现治疗后两组患者腰背疼痛、腰膝酸软、下肢痿弱、步履艰难等症状评分均较治疗前明显改善(P<0.01)，并且治疗9个月后观察组腰椎及股骨Ward三角区骨密度较治疗前明显提高(P<0.01)，而对照组未见明显改善，认为金天格胶囊用于原发性骨质疏松症患者的治疗，可以缓解腰背疼痛、腰膝酸软、下肢痿弱、步履艰难等症状，并能显著增加骨密度，改善生活质量，无明显不良反应。但是有学者认为人工虎骨粉并不能有效增加骨密度，陈志刚等[7]对120例骨量低下与原发性骨质疏松症患者进行口服人工虎骨粉胶囊治疗，发现治疗52周后其可抑制骨密度下降、有效缓解骨质疏松症的主要临床症状，但未能显著提高腰椎和和股骨颈的骨密度。对于人工虎骨粉对骨质疏松症患者骨密度的影响还需要更长期、更大样本的研究去证实。

本研究结果显示切除卵巢14周后，大鼠股骨骨密度下降，血清骨钙素、抗酒石酸酸性磷酸酶、钙、磷及碱性磷酸酶浓度均明显升高，股骨组织呈现骨质疏松病理改变，股骨最大载荷、断裂载荷、最大应力、弹性模量显著下降，说明实验造模成功。而经过人工虎骨粉干预后，去卵巢大鼠股骨密度升高，血清骨钙素、抗酒石酸酸性磷酸酶、钙、磷及碱性磷酸酶浓度均明显下降，股骨组织骨质疏松病理改变明显改善，股骨最大载荷、断裂载荷、最大应力、弹性模量显著升高，证实了人工虎骨粉可抑制骨质丢失，增强骨的力学强度，具有抗骨质疏松作用。

多种信号通路参与骨代谢紊乱的调节[8-9]。Sirt1是哺乳动物中与酵母沉默信息调节因子2同源性最高且具有NAD+依赖的蛋白去乙酰化酶活性的多功能调节因子，与基因转录、细胞衰老及能量代谢等过程的调节相关。大量的研究[10-11]已证实Sirt1与骨质疏松症的发生及发展密切相关。研究[12]发现白葫芦醇可通过促进Sirt1与成脂转录因子的结合阻碍骨髓间充质细胞向脂肪细胞的分化，进而促进骨形成。成脂转录因子也可抑制Runx2基因的转录活性及成骨信号通路，包括Wnt与转化生长因子/骨形态发生蛋白等。Runx2是启动成骨转录程序的早期主要因子，可诱导成骨细胞特异性基因的表达，如骨桥蛋白、骨钙素与碱性磷酸酶等。Sirt1//Foxo3A的过表达或沉默可影响Runx2启动子的活性，沉默Foxo1表达也可降低Runx2的表达，抑制骨形成[13-14]。由此可知Sirt1蛋白参与骨形成过程，Foxo1、Foxo3A、成脂转录因子等发挥了重要角色，而最终的调节目标是Runx2，所以笔者认为Sirt1/Runx2信号通路可能是未来研究防治骨质疏松症发生的主要研究方向。本研究结果显示切除卵巢14周后，大鼠股骨组织 Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表达降低，证实Sirt1/Runx2信号通路参与了骨质疏松的发生与发展；而人工虎骨粉干预后，去卵巢大鼠股骨组织 Sirt1、Runx2、Foxo1、Foxo3a蛋白表达升高，说明Sirt1/Runx2信号通路在人工虎骨粉治疗骨质疏松过程中发挥了积极作用。

综上，人工虎骨粉可能通过调节Sirt1/Runx2信号通路发挥抗骨质疏松的作用，但是骨质疏症的病理机制较复杂，涉及的信号通路较多，因此有关人工虎骨粉防治骨质疏松症的作用机制还有待进一步研究、阐明。