低氧诱导因子1α调控骨代谢和骨微环境血管生成的研究进展

张士花 元宇 邹军*

1.上海体育学院运动科学学院，上海 200438

2.华南师范大学体育科学学院，广东 广州 510631

骨血管为骨组织提供氧、营养、激素、细胞因子等物质，在骨生长发育、骨缺损修复以及骨代谢平衡中发挥重要作用。有研究[1]报道，骨组织血流量和骨密度高度相关，骨质疏松患者的骨血流量供给相对要低于正常人群。动物实验[2]也证实，去卵巢骨质疏松小鼠在骨量下降的同时伴随着骨血液供给水平的下降。近年来，《Nature》相继报道了两项研究[3-4]，关于骨血管生成与骨形成相互耦联，抑制骨血管生成导致骨形成受阻。此外，老年化导致的骨血管生成能力下降也抑制了骨形成，导致骨量流失。骨血管生成与骨形成是一个相互偶联的过程，骨血管的生成能够促进骨形成，成骨细胞也能够分泌促血管生成细胞因子调控血管内皮细胞的增殖及血管化[5]。低氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α，HIF-1α)在骨代谢过程中发挥着重要作用[6]，并且是血管生成的主要调节因子，通过与促血管生成因子如内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)等协同参与脉管系统形成[7]。血管生成是肿瘤生长的先决条件，自然杀伤细胞(natural killer cells，NK)中HIF-1α的缺失抑制了肿瘤生长[8]。关于非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)血管生成分子机制的研究表明，HIF-1α参与miR-206调节的血管生成过程，miR-206能够抑制STAT3 / HIF-1α/ VEGF途径来降低血管生成[9]。

目前，关于HIF-1α调控骨微环境血管生成的报道较为鲜见，因此，本文主要综述HIF-1α在骨微环境血管生成中的作用机制，为骨血管生成防治骨质疏松的机制研究提供理论基础。

1 HIF1α的生物学功能

HIF-1α是HIF-1蛋白家族的三个成员之一，由α亚基和β亚基组成的二聚体，在软骨细胞和其他细胞类型的氧稳态中起关键作用[10-11]。在含氧量正常的条件下，HIF-1α在氧依赖性降解(oxygen-dependent degradation，ODD)结构域内的关键脯氨酸残基处被脯氨酰羟化酶(prolyl hydroxylases，PHD)羟基化，羟基化时，HIF-1α与一种E3泛素连接酶(Von Hippel-Lindaum,VHL)蛋白结合，随后被蛋白酶体降解[11-13]。在低氧条件下，HIF-1α的脯氨酰羟基化被抑制，HIF-1α在细胞核中积累后与HIF-1的β亚基异二聚体反式激活HIF反应基因，包括参与血管生成的基因，如VEGF[14-16]。迄今为止，已经确定的HIF的靶基因有超过100个[17]，它们在多种生物过程中发挥不同作用，包括调控能量代谢、血管生成、红细胞生成、细胞存活、细胞凋亡和调节pH[18]。

HIF-1α能够通过靶向作用于GLUT1、ADRP、CAXII、VEGF等细胞因子调控各种生理过程[19]。如通过GLUT1调控葡萄糖的转运，通过ADRP调控脂代谢，通过CAXII调控细胞内pH稳态[20]。此外，HIF-1α还能通过激活BNIP3调节细胞自噬和凋亡过程[21]。

2 HIF1α调控骨代谢

高原鼠兔(ochotona curzoniae)是一种高耐缺氧物种，生活在青藏高原海拔3 000～5 000米处，Li等[22]发现在高原鼠兔的大多数组织中，HIF-1α蛋白表达水平明显高于生活在海平面的小鼠，并随着栖息地高度的增加而增加。在骨生成过程中，HIF-1α能够调控成骨细胞的增殖和迁移，促进BMP诱导干细胞成软骨分化，促进软骨细胞外基质的分泌。低氧环境下成骨细胞中HIF-1α表达上调，但成骨细胞活性降低且凋亡增多，过表达HIF-1α能缓解缺氧所引起的凋亡及活性降低，而敲除HIF-1α后成骨细胞活性进一步下降[23]。在小鼠中过表达HIF-1α能够增加骨形成，提高长骨体积[24]。这些研究提示，低氧应激时成骨细胞HIF-1α分泌适应性增多，HIF-1α能够调控VEGF等下游基因促进骨血管生成，同时能够缓解缺氧引起的细胞凋亡，促进成骨细胞的增殖及分化，促进骨形成。

在破骨细胞中，HIF-1α似乎扮演着另一种角色。破骨细胞位于低氧骨膜区域，当卵巢功能正常时，雌激素抑制破骨细胞HIF-1α功能；去卵巢后，雌激素缺乏致使HIF-1α功能趋向稳定，破骨细胞活性增强，促进骨吸收。给予外源性雌激素干预后，HIF-1α受到抑制，骨吸收减弱[25]。此外，将去卵巢小鼠破骨细胞HIF-1α基因敲除后，破骨细胞活性减弱，骨量增加。在睾丸切除的雄鼠中也发现类似现象，睾丸切除后HIF-1α蛋白表达上调，骨量流失；补充睾酮后HIF-1α受到抑制，骨吸收减弱[26]。由此表明，抑制破骨细胞中HIF-1α表达能够抑制破骨细胞活性，削弱骨吸收，改善骨代谢。

在软骨内骨形成期间，生长板中心内的软骨细胞增殖并合成无血管细胞外基质,随着软骨细胞的增殖和分化会出现软骨细胞肥大并释放相关分子，包括刺激血管侵入生长板的促血管生成细胞因子VEGF[27]，在骨骼发育和骨修复中，VEGF依赖性血管侵入无血管软骨是骨形成的关键步骤[28]，HIF-1α信号传导在该过程中参与血管生成和骨生成的耦合。近期，Stegen等[29]发表在《Nature》的研究报道了软骨细胞中过度的HIF-1α信号传导通过干扰细胞的生物能和生物合成致使骨骼发育不良。其具体机制体现在葡萄糖氧化的减少导致能量缺乏，这限制了细胞的增殖，激活了未折叠蛋白质反应同时也减少胶原蛋白的合成，外源性补充谷氨酰胺使之通量增加，进而α-酮戊二酸水平升高，这又反过来增加了胶原蛋白上的脯氨酸和赖氨酸羟基化。在这种代谢调节方式下的胶原蛋白修饰使得软骨基质能更好的抵抗蛋白酶介导的降解，从而增加骨量。因此，不适当的HIF-1α信号传导会导致由胶原蛋白过度修饰引起的骨骼发育不良，这种效应也可能导致与细胞外基质相关的其他疾病，例如癌症和纤维化[29]。

近期有研究[30]报道，在microRNAs调控骨代谢过程中HIF-1α也发挥了重要的介导作用。关于miR-21在促进骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)的迁移和成骨分化的实验中发现，miR-21通过增加P-Akt和HIF-1α活化程度来促进BMSCs的成骨分化能力。Costa V等[31]采用荧光激活细胞分选术(fluorescence-activated cell sorting, FACS)，通过基因表达和蛋白质分析来研究HIF-1α和miR-675-5p在血管生成和成骨耦合作用的相关研究中发现，miR-675-5p通过增加HIF-1α表达和激活Wnt /β-catenin信号通路来促进人骨髓间充质干细胞(human bone marrow mesenchymal stem cells,hMSC)向成骨细胞分化。

3 HIF1α调控骨微环境血管生成

成体哺乳动物(包括人)外周血、骨髓中的内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)与骨髓中的多能成体祖细胞(multipotent adult progenitor cells,MAPCS)在体内外均可分化为成熟血管内皮细胞(endothelial cells，ECs)，且聚集于靶器官，参与新血管的形成过程[32]。许多细胞因子都具有成血管活性，一项关于HIF-1α信号传导在调节血管生成素(angiogenin，ANG)表达和上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)在缺氧视网膜色素上皮细胞中作用的研究[33]发现，在ARPe-19的缺氧小鼠模型中，ANG的表达水平增加，阻断HIF-1α信号传导会抑制ANG的高表达。目前已知受HIF-1α调控的下游基因有60多种,其中最主要的下游基因是VEGF[34]，在HIF-1α缺失的情况下，VEGF表达降低[35]。进一步研究[36]发现，HIF-1α通过与VEGF启动子区域中的缺氧反应元件结合而上调VEGF的产生，内皮细胞生长因子受体1(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR-1) 和内皮细胞生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR-2) 是在内皮细胞上表达的两种均由HIF-1α介导的受体，而VEGF是通过VEGFR-1和VEGFR-2实现内皮细胞的趋化和促进有丝分裂，进而引起细胞增殖、迁移和血管生成[37]，提示HIF-1α在血管生成中有着不可或缺的作用。有研究[38-39]报道，HIF-1α在诱导血管生成中效果显著,其诱导的新生血管结构正常,无组织水肿、血管平直舒缓少曲折,囊性血管形成率几乎为零。

骨骼是一种高度血管化的组织，但骨腔中的骨微环境则是一个天然的低氧环境。在骨组织中，氧分压约为1%～6%或小于1%，其中骨内膜氧分压小于1.8%，骨腔内血管氧分压小于1.3%[40-41]。HIF-1α是低氧或缺氧条件下调控细胞内稳态的核心转录因子。低氧时HIF-1α分泌增多并转运至细胞核中与 HIF-1β 形成聚合体，启动VEGF及促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)等下游基因的转录，引起一系列的耐氧适应性反应[42]。

在血管的发育过程中,HIF-1α通过调控 VEGF 基因促进血管生成。低表达HIF-1α时，即便是在低氧条件下，VEGF 表达也会受到抑制。HIF-1α还能介导VEGF调控血管生成与骨生成间的耦联[43]。在骨生成过程中，软骨细胞分泌VEGF并激活血管的生成，促进软骨发育。过表达HIF-1α能诱导VEGF等血管生成因子过量分泌，刺激长骨血管生成，在血管过度生长的长骨区域也伴随着过度活跃的骨生成现象[44]。近年Kusumbe等[45]在Nature上报道，在小鼠的骨骼系统中存在H型内皮及L型内皮两种特殊的毛细血管亚型，其中H型内皮是骨血管生成的关键，成骨细胞及其前体细胞主要分布在H型内皮细胞周围。而过表达HIF-1α能够扩增H型内皮及干骺端血管，提高成骨细胞前体细胞数，促进骨生成[24]。

VHL基因敲出小鼠的HIF-1α表达显著上调，血管分布明显增加，并且在牵引成骨过程中骨生成增加，但在成骨细胞中缺乏HIF-1α的小鼠血管新生和骨愈合明显受损[46]，过表达HIF-1α的MSC血管生成和成骨活性都有明显增强[47-48]。去铁胺(deferoxamine，DFO)是一种广泛使用的缺氧模仿剂[16,49]。在一项有关促进骨质疏松性骨缺损愈合的潜在机制研究[50]中，用DFO构建缺氧模型，从聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA) 释放的DFO可以激活HIF-1α信号通路后影响几种下游的血管生成因子，包括VEGF、FGF-2、ANGFT-1。VEGF和FGF-2不仅促进血管生成，而且对MSC的成骨分化具有刺激作用[51-53]，因此HIF-1α在加速骨缺损愈合过程中发挥重要作用。

胫骨软骨发育不全(tibial dyschondroplasia,TD)是一种棘手的家禽疾病，其特征是胫骨生长板(tibial growth plates，TGP)中出现非血管化和非矿化的软骨块[54]，其病因是由于血液供应降低或缺乏导致胫骨软骨细胞死亡，进而导致骨骼发育异常。Genin等[55]的研究表明，脉管系统缺失与TD生长板损伤关系重大，且可能与HIF-1α的表达异常有关。一项关于血管生成与TD的研究[54]发现，TD的直接原因是胫骨血管生成受到抑制，抑制HIF-1α和VEGFA / VEGFR信号传导途径能够阻断软骨细胞的营养供应，导致软骨细胞死亡，胫骨生长板发育受阻。而上调HIF-1α能够激活VEGFA及其在软骨细胞中的受体，进而刺激血管生成，从而实现在缺氧条件下促进胫骨生长板的正常发育。见图1。

图1 HIF-1α调控骨代谢、骨微环境血管生成作用机制图Fig.1 Mechanism of HIF-1α regulating bone metabolism and angiogenesis in bone microenvironment

4 小结

HIF-1α在骨代谢中发挥着重要作用，能够调控成骨细胞、破骨细胞以及软骨细胞的增殖、活性及功能。HIF-1α还广泛参与血管生成过程的调控。在骨微环境中，血管生成能力的减弱将导致骨形成能力衰退。HIF-1α能够通过调控 VEGF及FGF2等血管生成因子促进血管生成，进而促进骨形成。目前关于HIF-1α在骨血管生成中的研究还处于初级阶段，其确切机制尚未清楚，如HIF-1α与外泌体、非编码RNA之间的关系及其在骨血管生成中的调控作用等仍有待更深入地进一步研究。