磺胺类药物的多残留酶联免疫法检测

陈曼娜

（广东省潮州市人民医院 广东潮州 521011）

1 引言

磺胺类药物通过干扰细菌酶系统中的氨基苯甲酸，破坏其自我增值能力，对细菌产生极强的抑制作用，从而达到杀菌目的。由于其出色的杀菌能力，且在实际应用中有经济、高效、稳定等优点，常被应用于细菌性感染和原虫感染等疾病中。控制兽药残留最主要的措施是加强兽药残留的检测和监控，我国规定动物性食品中单个药物最高残留限量为0.1 mg/kg[1]。

2 材料和检测方法

2.1 材料和仪器

试验对象：6只白兔，体重在2.5 kg左右；3只鸡，体重在1.5 kg左右。

试验材料：新鲜牛奶；包被原H2-OVA；免疫原H1-HSA、H1-BSA 等。

试剂：辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G（HRP-IgG）；新生牛血清；卵清蛋白（OVA）；各类磺胺类药物：磺胺二甲基嘧啶（SM2）；磺胺嘧啶（SD）；磺胺喹恶啉（SQ）；磺胺氯吡嗪钠（SC）；磺胺甲基异恶唑（SMZ）；磺胺对甲氧嘧啶（SMD）；磺胺-6-甲氧嘧啶（SMM）[2]。

仪器：电子天平；超纯水设备；酶标仪器；离心机；恒温水槽；恒温干燥箱。

2.2 磺胺类药物多克隆抗体制备

2.2.1 免疫程序接种

参考常规免疫程序对家兔进行免疫试验，在试验前分别采用H1-BSA和H1-HSA作为免疫抗体，以0.5 mg/kg的剂量对3只新西兰白兔进行免疫试验。在抗原溶液中注入等体积的弗氏完全佐剂，乳化完全后，采用皮内多点注射法对白兔后背皮肉进行注射，每次剂量控制在0.1～0.2 mL。将抗原溶液与弗氏不完全佐剂等体积融合，间隔3周后，以背部皮下注射的方式做第二次免疫，之后分别间隔2周后做第三次和第四次免疫。再间隔2周后，将1 mg完全抗原溶液溶于生理盐水中，通过耳缘静脉注射，进行第五次免疫，1周后对颈动脉进行分离采血得到抗血清物质[3]。

2.2.2 纯化抗血清

采用三步盐析法对抗血清进行纯化，主要试剂为饱和硫酸铵，使用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）进行纯化效果的最终鉴定，并将样本在-20℃条件下低温保存。

2.3 建立免疫学分析法

2.3.1 酶联免疫法（ELISA）确定最佳抗原抗体浓度

以H2-OVA为抗原溶液，以羊抗兔HRP-IgG组建酶标酶联免疫试验。对抗体的重点效价进行解析，得出抗原抗体的最佳浓度[4]。

2.3.2 ELISA标准曲线的建立

对于 7种常用磺胺类药物（SM2、SD、SQ、SC、SMZ、SMD、SMM）进行间接竞争试验，确定抗原抗体的工作条件，以竞争物底物浓度的对数为横坐标，绘制出相应的标准曲线，完成相关的参数分析[5]。

2.4 磺胺类药物在多克隆抗体中的应用

2.4.1 测定牛奶中磺胺药的含量

对新鲜牛奶进行处理，在常温下以4 000 r/min转速进行离心，取样下层清液进行分析。

2.4.2 测定鸡样品中磺胺类药物的含量

取样品鸡宰杀，取鸡胸肌和肝脏作为待测样品，将鸡胸肉和肝脏剪碎后放于离心管内，加入乙腈和乙酸乙酯，震荡离心，取下层溶液，添加 0.1、1.0、5.0 μg/mL 3个浓度梯度的磺胺药，根据磺胺药物的浓度抑制曲线和回归方程得到最终结果的回收率。

3 结果

3.1 抗原抗体中最佳浓度值的确认

用酶联免疫方阵对试验做最佳浓度分析与确认，以抗效价1∶85000作为间接酶联免疫法的最佳浓度，详见表1。

表1 间接酶联免疫法方阵试验分析

3.2 标准曲线相关参数

以依据表1数据对7种磺胺类药物的抑制率进行测算，以磺胺类药物浓度的对数为横坐标，抗原抗体结合率为纵坐标绘制标准曲线，详见表2。

表2 磺胺类药物间接竞争标准曲线相关参数

3.3 牛奶添加药物回收率

添加100 ng/mL磺胺类药物时，回收率为77.8%，相对标准偏差（RSD）为2.47%；添加1 000 ng/mL时，回收率为79.4%，RSD为2.62%；添加5000ng/mL，回收率为101.3%，RSD为4.1%。结果表明，磺胺类药物在100～5 000 ng/mL时，具有良好的回收率。

4 讨论

本文以磺胺类药物母核结构的完全抗原作为H1-HSA、H2-OVA研究的免疫原和包被原，以降低杂质感染，提高检测分析的灵敏度。H1-HSA对免疫家兔的抗血清体现了良好的灵敏性，对常用的7种磺胺药能够有效识别，5种检测限低于最高残留量（100 ng/mL）。本文主要对抗体中磺胺类药物的残留量进行定性分析，可以提高检测试剂在实际应用中的特异性、灵敏性、分离能力以及准确度，以此提高分析效率，实现多残留检测的目的。