印迹基因H19和IGF2的表达与葡萄胎恶变关系的分析研究*

华金仁 郑 芳 程慧明 潘 玫

江西省妇幼保健院，江西省南昌市 330006

葡萄胎是一种常见良性滋养细胞疾病，存在恶变倾向，临床极易因治疗不当或其他因素，致使葡萄胎转变为绒毛膜癌或侵蚀性葡萄胎，影响患者生命健康[1]。目前认为，妊娠滋养细胞肿瘤一个重要特征为肿瘤细胞破坏力强、经血行转移时间早，故早期预防、治疗葡萄胎恶变至关重要[2]。葡萄胎恶变影响因素较多，包括年龄、孕次、先行妊娠间隔时间等。近年来，研究发现印迹基因可经单亲传递某些遗传性状，对胎儿及胎盘正常发育、细胞分化及增殖产生影响[3]。而胰岛素样生长因子2(IGF2)基因属于印迹基因研究史上最早被发现的内源性印迹基因。H19是目前唯一发现的不表达蛋白质而在mRNA水平上发挥作用的印迹基因。目前，临床就葡萄胎恶变与印迹基因H19和IGF2表达相关性研究仍较少。本研究重点分析了葡萄胎恶变与印迹基因H19和IGF2表达的关系，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 随机选取2016年9月—2018年9月本院78例葡萄胎患者。纳入标准：(1)符合《妇产科学》[4]中葡萄胎诊断标准，经胸片、B超或术后病理等检查确诊为良性葡萄胎；(2)可获得首次清宫新鲜葡萄胎组织；(3)临床资料完整。排除标准：(1)既往有清宫术史；(2)葡萄胎排出前存在阴道转移或肺转移；(3)有家族性葡萄胎史。其中，年龄20～39岁，平均年龄(28.21±6.23)岁；孕次1～4次，平均孕次(2.85±0.74)次；产次0～3次，平均产次(1.26±0.64)次；完全性葡萄胎28例，部分性葡萄胎50例。

1.2 方法

1.2.1 仪器与试剂：仪器包括日本Thermo公司提供的台式低温微量高速离心机、江苏苏州净化设备厂提供的超净工作台、美国Bio-Rad公司提供的分光光度仪及PCR仪、德国Sartorius公司提供的凝胶成像系统等。试剂包括上海金穗生物有限公司提供的无水乙醇、南京金斯瑞生物科技有限公司提供的H19、IGF2引物等。

1.2.2 实验方法：取25～50mg新鲜葡萄胎组织，以1ml DNAiso Reagent滴入，匀浆，至无块状沉淀，室温下静置5min。离心，10min，取上清液。加入DNAiso Reagent 1/2体积量无水乙醇，观察出现云雾状DNA沉淀，倒出上清液，离心管底部留DNA沉淀。以75%乙醇1ml滴入，上下颠倒，离心，弃乙醇。去乙醇后基因组DNA沉淀室温下干燥，持续30s；灭菌水溶解，置于-80℃冰箱备用。以分光光度仪检测DNA浓度(OD 260nm×50×0.04)、纯度(OD 260nm/OD 280nm)。设计H19、IGF2引物，经BLASH验证。H19 PCR反应仪95℃预变形，持续5min；95℃变性，持续30s；61℃退火，持续30s；72℃延伸，持续10s。共35个循环，4℃。IGF2 PCR反应仪95℃预变形，持续5min；95℃变性，持续30s；58℃退火，持续30s；72℃延伸，持续10s。共35个循环，72℃延伸，持续5min，4℃。混匀1μl 6×DNA上样缓冲液、5μl PCR液，上样于3%琼脂糖凝胶，电泳，EB染色，在凝胶成像系统下观察。H19阳性为出现397bp扩增条带，仅出现397bp为a型等位基因表达，仅出现168bp或229bp为b型等位基因表达，出现397bp、168bp、229bp为ab型等位基因表达。IGF2阳性为出现236bp扩增条带，仅出现236bp为a型等位基因表达，仅出现173bp为b型等位基因表达，出现236bp、173bp为ab型等位基因表达。

1.2.3 随访：清宫术后每隔3个月随访1次，共12个月。观察葡萄胎恶变率，恶变采用有无阴道异常流血、妇科检查、胸片、盆腔彩超等检查确诊。随访结束时，恶变19例，未恶变59例。

1.3 统计学方法 以SPSS20.0软件分析所得数据。计数资料以χ2检验对比。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H19基因在葡萄胎组织中等位基因表达 两组H19DNA基因型、RNA等位基因表达对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 H19基因在葡萄胎组织中等位基因表达分析[n(%)]

2.2 IGF2基因在葡萄胎组织中等位基因表达 两组IGF2DNA基因型、RNA等位基因表达对比，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 IGF2基因在葡萄胎组织中等位基因表达分析[n(%)]

3 讨论

妊娠滋养细胞疾病在临床上较为常见，主要源自胎盘滋养细胞，且涉及类型较多，包括葡萄胎、胎盘部位滋养细胞肿瘤等，其中葡萄胎最为常见。葡萄胎虽属于良性病变，但也存在一定恶变倾向。据调查，50%左右绒毛膜癌、侵蚀性葡萄胎由葡萄胎恶变所致[5]，而早期预测、诊断葡萄胎恶变，对指导治疗方案制定，改善预后，具有重要价值[6]。印迹基因是仅表达某一亲本来源的等位基因，在遗传性疾病、肿瘤发生及发展中发挥一定作用。

H19、IGF2为目前被较好认知的印迹基因类型，属同一个基因印迹群。其中，H19基因属于母源性印迹基因，有一酶切位点RSAI，而IGF2属于父源性印迹基因，有一酶切位点APAI。当样本为纯合子时，较难准确鉴别是单等位基因表达还是双等位基因表达，故临床采用RFLP技术进行印迹状态研究时，需先明确基因型，选取杂合子，以确定基因印迹表达。目前认为，印迹基因表达改变在肿瘤发生、发展中有一定作用，而基因甲基化是影响基因印迹改变的重要因素，多出现在生殖细胞分裂时。但临床就葡萄胎恶变中H19、IGF2表达改变有无关联仍无明确结论，且相关研究较少。本研究就该问题进行分析，自表1、表2可以看出，葡萄胎恶变与未恶变患者两种印迹基因DNA基因型、RNA等位基因表达均无显著差异，推测H19、IGF2基因表达与葡萄胎恶变无明显相关性，但本研究并未明确相关具体机制，今后仍需加大研究力度，进行更深层次调查分析。

综上所述，H19、IGF2基因表达与葡萄胎恶变无明显相关性，但相关具体机制仍未明确，今后仍需大量研究。