微RNA-21在THP-1细胞中对STAT3/STAT5表达的影响

郑玉，张文哲，董利阳，王婷，汪雪峰

(江苏大学附属医院中心实验室，江苏 镇江 212001)

人源单核白血病细胞株THP-1细胞系是体外进行单核-巨噬细胞分化和功能、信号通路机制等研究的常用细胞系，能够在体外诱导为巨噬细胞，最初从1例急性单核细胞性白血病患者外周血中分离获得[1-2]。巨噬细胞作为一种重要的抗原呈递细胞，参与炎症反应、癌症及多种自身免疫或炎症性疾病的病理改变[3]。

微RNA-21(microRNA-21，miR-21)是一类在多种哺乳动物细胞中丰富表达的非编码RNA[4-5]，在炎症和免疫系统功能调节中发挥重要作用[6-7]。目前公认的miR-21靶基因包括磷酸酶及张力蛋白同源缺失性基因、凋亡相关蛋白4抗原等[8]。近年来，对miR-21与信号转导及转录激活因子(signal transducer and activator of transcription，STAT)3相互作用的研究越来越多。在胶质母细胞瘤中，miR-21以STAT3依赖方式下调人端粒酶逆转录酶表达，从而抑制胶质母细胞瘤细胞生长[9]。STAT通路上游是酪氨酸激酶家族蛋白，能够整合来自不同通路的信号，其中STAT3、STAT5具有共同的结构基序，可以被多种细胞因子和生长因子活化，持续的STAT3/STAT5活化可促进慢性炎症，提高健康细胞的致癌敏感性，因而在炎症与癌症的研究中逐渐受到重视[10]。Dong等[11]的研究发现，类风湿关节炎患者外周血中miR-21的表达水平下降，并伴有STAT3表达及活化增加，STAT5及其磷酸化蛋白、调节性T细胞关键转录因子叉头转录因子3的表达减少，提示miR-21可能通过STAT3/STAT5调控T细胞的分化与自稳，参与类风湿关节炎的炎症反应。本研究使用miR-21过表达及抑制的慢病毒颗粒感染细胞，获得稳定转染的THP-1细胞系，对miR-21在炎症反应中的作用进行深入研究，以期为miR-21的生物学特性及其在免疫细胞调控中作用的研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1材料 THP-1细胞株为江苏大学中心实验室保存；LV-miR-21、LV-miR-21 Sponge、LV-GFP-Puro慢病毒颗粒(上海吉玛制药有限公司，批号：20180203；20180330；20180129)；All-in-OneTMmiRNA实时荧光定量聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)检测试剂盒；Lipofectamine 2000(美国Thermo公司，批号：11668-500)；嘌呤霉素(美国Target Mol公司，批号：ITM10036649)；辣根过氧化物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白G抗体(上海碧云天生物技术有限公司，批号：Sa00001-2)、兔抗人STAT3(美国Cell Signaling Technology公司，批号：Ba0621)、STAT5抗体(美国Cell Signaling Technology公司，批号：Ba1411)。

1.2方法

1.2.1LV-miR-21、LV-miR-21 Sponge、LV-GFP-Puro 慢病毒颗粒感染THP-1细胞 使用96孔板测定感染复数值为10、50、100、200时THP-1细胞的转染效率。当感染复数值为100时，观察THP-1细胞转染效率最高，且未见细胞出现明显的形态改变。感染前1天对THP-1细胞进行计数，按照2×104个/孔接种于96孔板。24 h后细胞融合率为50%～70%，弃去细胞培养基，使用磷酸盐缓冲溶液洗涤1次，向6孔板中加入聚凝胺溶液5 mg/L预刺激30 min；取病毒上清加入相应THP-1细胞的96孔板中(感染复数为100)，4 h后定容至100 μL，感染8～12 h后更换正常RPMI-1640完全培养基；72 h后在倒置荧光显微镜下观察培养皿中的细胞，镜下随机选取视野，分别于明暗视野观察细胞绿色荧光蛋白表达情况，计算转染效率。

1.2.2嘌呤霉素筛选稳定细胞株 病毒感染48 h后，将培养液更换为含2 mg/L嘌呤霉素的RPMI-1640完全培养基进行抗性筛选，同时以未感染病毒的THP-1细胞作为阴性对照。培养2 d后，阴性对照组细胞全部死亡，病毒感染组细胞正常生长。根据转染慢病毒颗粒的不同将转染后的THP-1细胞分为对照组(转染LV-GFP-Puro慢病毒颗粒)、LV-miR-21组(转染LV-miR-21慢病毒颗粒，过表达miR-21)和miR-21 Sponge组(转染LV-miR-21 Sponge慢病毒颗粒，抑制miR-21表达)。

1.2.3miR-21靶基因STAT3的生物信息学分析 使用miRNA靶基因预测软件miRanda database(http://www.mirbase.org/)对人miR-21进行靶基因预测。

1.2.4检测THP-1细胞中miR-21、STAT3、STAT5信使RNA(messenger RNA，mRNA)的表达 采用实时荧光定量PCR检测THP-1细胞中miR-21、STAT3、STAT5 mRNA的表达。收集6孔板细胞，使用Trizol RNA分离试剂(美国Sigma-Aldrich公司，批号：BCBV9270)提取细胞总RNA，并逆转录为互补DNA。引物：miR-21(cat.no.HmiRQP0316)以U6(cat.no.HmiRQP9001)为内参基因；STAT3(cat.no.HQP017767)、STAT5a(cat.no.HQP017771)、STAT5b(cat.no.HQP017774)以人甘油醛-3-磷酸脱氢酶(cat.no.HQP006940)为内参基因。使用All-in-OneTMmiRNA实时荧光定量PCR检测试剂盒进行上机检测。反应体系为25 μL，反应参数为95 ℃预变性10 min，1个循环；95 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸15 s，40个循环。甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参，操作严格按照试剂说明书进行，设置3个复孔，使用2-ΔΔCT法计算RNA的相对表达量。

1.2.5检测THP-1细胞中STAT3、STAT5的表达 采用蛋白电泳法检测THP-1细胞中STAT3、STAT5的表达。将各组THP-1细胞以180×g，离心5 min，去掉培养基后，使用1 mL磷酸盐缓冲溶液洗涤2～3次；用细胞及组织蛋白裂解液、磷酸蛋白酶抑制剂、苯甲基磺酰氟配置裂解液，提取细胞蛋白。将总蛋白煮沸10 min使其变性；取适量蛋白样品进行电泳，并电转移至聚偏二氟乙烯膜，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，加入1∶1 000稀释的一抗，4 ℃条件下孵育约16 h，洗涤液洗膜3次后，分别加入辣根过氧化物酶标记的免疫球蛋白G二抗(羊抗兔1∶1 000)，室温孵育1 h，洗涤液洗膜5次，加入曝光液暗室孵育约30 s，利用Tanon5200超灵敏化学发光成像仪(上海天能科技有限公司，型号：Tanon5200)进行显色，采用LAND-1软件进行灰度扫描。

2 结 果

2.1三组慢病毒颗粒的转染情况 倒置荧光显微镜下，绿色荧光蛋白表达阳性细胞呈悬浮状态，LV-miR-21 组、miR-21 Sponge组及对照组THP-1细胞的转染率达90%以上，表明病毒颗粒可在THP-1细胞中表达蛋白，见图1。

2.2三组感染慢病毒颗粒THP-1细胞中miR-21的表达水平比较 实时荧光定量PCR结果显示，三组miR-21的表达水平比较差异有统计学意义(P<0.01)，LV-miR-21组miR-21表达水平高于对照组，miR-21 Sponge组的miR-21表达水平低于LV-miR-21组，见表1。

表1 三组感染慢病毒颗粒THP-1细胞中miR-21的表达水平比较

2.3miR-21靶基因STAT3预测结果 采用miRanda database在线理论预测软件进行分析发现，理论上STAT3基因的3′非翻译区与miR-21存在7个碱基互补区，见图2。

STAT：信号转导及转录激活因子；3′UTR:3′非翻译区；miRNA：微RNA

2.4三组感染慢病毒颗粒THP-1细胞中STAT3、STAT5 mRNA的表达 实时荧光定量PCR结果显示，三组STAT3比较差异有统计学意义(P<0.01)，LV-miR-21组THP-1细胞中STAT3 mRNA的表达水平低于对照组，miR-21 Sponge组STAT3 mRNA表达水平高于对照组和LV-miR-21组(P<0.05)；三组STAT5a、STAT5b mRNA的表达水平比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 三组感染慢病毒颗粒THP-1细胞中STAT3、STAT5 mRNA的表达水平比较

2.5三组感染慢病毒颗粒THP-1细胞中STAT3、STAT5蛋白表达的比较 使用LAND-1软件对蛋白免疫印迹法检测结果进行灰度扫描显示，与对照组相比，LV-miR-21组THP-1细胞中STAT3蛋白表达下调，STAT5蛋白表达上调；而miR-21 Sponge组THP-1细胞中STAT3蛋白表达上调，STAT5蛋白表达下调，见图3。

STAT：信号转导及转录激活因子；miRNA：微RNA；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脱氢酶；Fold:灰度值

3 讨 论

miR-21是一种重要的致癌小RNA分子，在多种肿瘤患者血清中高表达，与肿瘤的发生、发展及免疫反应调控密切相关[12-14]。研究发现，miR-21在多种炎症及自身免疫反应中表达异常，可调节多种免疫细胞的分化、增殖及活化。已有研究表明，miR-21通过下调树突状细胞中白细胞介素(interleukin，IL)-35的表达影响辅助性T细胞(helper T cell，Th细胞)1/Th2细胞平衡[15]，通过下调Smad7(T细胞中Th17细胞分化的负调控因子)的表达，促进Th17细胞的分化[16]。STAT3和STAT5是STATs家族的重要成员，STAT5存在两种异构体即STAT5a和STAT5b，两者有94%的同源性，STAT5a主要表达于哺乳动物腺体，STAT5b主要表达于肌肉和肝脏[17]，但STAT3、STAT5a、STAT5b可以被IL-6、胰岛素样生长因子、集落刺激因子-1等活化，参与多种疾病的炎症反应[18-20]。既往研究发现，miR-21可通过STAT3/STAT5调控类风湿关节炎患者Th17/调节性T细胞(regulatory T cell,Treg细胞)的失衡[11]。为了进一步研究免疫细胞中miR-21的生物学功能，本研究使用miR-21过表达及抑制慢病毒颗粒感染，经嘌呤霉素筛选后获得能够稳定过表达或抑miR-21的THP-1细胞。

本研究中，与对照组比较，miR-21 Sponge组中miR-21的表达水平未见明显改变，而STAT3 mRNA的表达水平升高。研究显示，慢病毒感染THP-1细胞较其他稳转方法的效率更高[21]，故本研究选用慢病毒颗粒构建miR-21过表达及抑制的THP-1细胞系。倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达水平，并采用实时荧光定量PCR检测miR-21对模型进行验证。miRanda在线预测软件提示，miR-21与STAT3之间可能存在靶向关系，鉴于STAT5与STAT3同属于STAT家族，具有共同的结构基序，可以被相同的细胞因子或生长因子激活，参与信号转录及多种疾病的炎症反应[10]，故可检测THP-1细胞中STAT3、STAT5的表达水平。Zhou等[22]的研究显示，miR-21-5p转染CD4+T细胞后能够直接靶向STAT3，介导T细胞亚群失衡。本研究中，THP-1细胞感染LV-miR-21及miR-21 Sponge后，STAT5a、STAT5b mRNA表达水平无明显差异，然而，蛋白电泳显示LV-miR-21组STAT5表达增多，miR-21 Sponge组STAT5表达降低，提示miR-21可影响转录后STAT5水平的表达。与前期对类风湿关节炎患者外周血研究中，miR-21低表达并伴STAT3表达及活化增加以及STAT5及其磷酸化蛋白表达减少一致[11]。

有关STAT3、STAT5的早期研究主要集中在对肿瘤发生发展的作用[23]。研究表明，STAT3、STAT5对Th17细胞和Treg细胞的分化至关重要。在转化生长因子-β和IL-6的存在下，STAT3能够激活Th17细胞的特异性转录因子视黄酸相关孤独核受体γt，进而参与Th17细胞分化[24]，Th17细胞通过分泌IL-17A及相关细胞因子发挥促炎作用[25]。此外，STAT3信号通路激活后亦能够促使叉头转录因子3基因增强子中的重要结构CpG岛发生甲基化，从而抑制RNA水平上叉头转录因子3的表达以及Treg细胞的分化[26]。一方面，STAT5是调控Treg细胞分化的特异性转录因子叉头转录因子3表达的关键因子，在IL-2、转化生长因子-β及抗原信号存在的条件下促进原始CD4+T细胞向Treg细胞分化；另一方面，STAT5能够与STAT3竞争IL-17基因结合位点，抑制Th17细胞的分化[27]。Treg细胞通过细胞接触、分泌IL-35、IL-10、转化生长因子-β等抑制性细胞因子方式抑制靶细胞代谢等，在维持机体免疫耐受、炎症、肿瘤等疾病中发挥重要的作用[28-29]。Th17细胞和Treg细胞在分化过程中相互关联，在功能上却相互拮抗。STAT3、STAT5对免疫系统的影响主要是通过影响Th17和Treg细胞的分化以及制约Th17与Treg细胞之间的平衡而实现的，在类风湿关节炎、儿童过敏性紫癜等疾病的治疗中具有重要意义[30]。miR-21可能通过调控STAT3、STAT5参与炎症中免疫反应，但其具体机制有待进一步研究。

综上所述，本实验成功构建了能够稳定过表达和抑制miR-21的THP-1细胞系，为进一步研究miR-21的生物学特性及其在免疫细胞调控中的作用奠定了基础。在THP-1细胞中的miR-21可在RNA和蛋白水平抑制STAT3的表达，并正向调节STAT5蛋白的表达。