PEG 6 000胁迫条件下华北八宝愈伤组织中抗氧化酶活性的变化

黄航君，李依，马林喜，马伟伟，王俊丽

(中央民族大学 生命与环境科学学院，北京 100081)

华北八宝Hylotelephiumtatarinowii(Maxim.)H. Ohba又称华北景天，是景天科Crassulaceae八宝属Hylotelephium的多年生草本植物，分布于山西、河北、内蒙古等地，生长地的海拔高度为1 000～3 000 m，常见于向阳山石上[1].

作为一种优良的香草植物，华北八宝可用于园林绿化和城市造景[2]，也可用做食品或饲料，或者提取精油.石进朝等[3]引种试验结果表明，将生于高海拔的华北八宝引种到低海拔的地区，能正常生长.

华北八宝是典型的旱生植物.那冬晨等[4]研究发现，在干旱胁迫条件下，华北八宝叶绿素含量有所增加，并且能维持植物正常的光合作用.华北八宝可以通过可溶性蛋白的渗透调节作用来维持细胞的正常生长和代谢.那冬晨[5]研究了华北八宝抵抗干旱胁迫的机理.结果发现，在干旱胁迫条件下，其可溶性糖和游离脯氨酸的含量没有明显变化，而可溶性蛋白的含量发生了明显改变.

张璐等[6]对华北八宝进行了离体培养研究，诱导出了愈伤组织，建立了再生体系，并对黄酮类化合物的含量进行了测定.本研究以此为基础，测定华北八宝愈伤组织在PEG胁迫下酶活性的变化，为研究其抗旱机制提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 植物材料

本实验所用的华北八宝野生植株采自北京市门头沟区的灵山(海拔高度为2 300 m).

1.2 华北八宝愈伤组织的诱导与增殖培养

选取叶片，先在流水下冲洗2 h，用体积分数70%的乙醇表面消毒30 s，用质量分数为0.1% 的HgCl2消毒12 min，再用无菌水冲洗3～4次.以无菌叶片(0.5 cm×0.5 cm)为外植体，接种至MS(Murashige & Skoog) + 2，4-D(2，4-Dichlorophenoxyacetic acid) 2.0 mg/L + 6-BA(6-Benzyladenine ) 0.5 mg/L培养基上，在温度为(25 ± 2) ℃、光照12 h/d、光强为2 000～3 000 lx的条件下进行愈伤组织的诱导.30 d后将诱导出的愈伤组织再接种到同样的培养基上进行增殖培养.

1.3 愈伤组织的PEG 6 000胁迫处理

采用PEG 6 000进行胁迫处理.将质量分数分别为0(对照组)、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、8.0%的PEG 6 000添加到MS + 2,4-D 2.0 mg/L + 6-BA 0.5 mg/L中，将愈伤组织切成小块(体积约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)接种到含不同质量分数PEG 6 000的培养基上进行培养，每隔12 h进行取样，每个处理组取样10次.将所取样品放到液氮中快速冷冻，之后保存于-80 ℃冰箱中.实验重复3次.

1.4 酶的提取

分别取样品0.2 g，置于预冷过的研钵内，加入液氮研磨至粉末状，依次加入0.6、0.5、0.5 mL的磷酸缓冲液(pH = 7.8，0.05 mol/L)，共计1.6 mL，转入2 mL离心管中进行离心(4 ℃、12 000g下离心20 min)，上清液即为酶粗提液.

1.5 酶活性的测定

过氧化物酶(POD)活性采用愈创木酚法进行测定[7].过氧化氢酶(CAT)活性采用紫外分光光度法进行测定[7].超氧化物歧化酶(SOD)活性采用NBT光化还原法进行测定[7].

1.6 同工酶分析

1.6.1 酶液制备

称取1.0 g低温(-80 ℃)保存的愈伤组织，置于液氮预冷过的研钵中，加液氮研磨至粉末状，转入预冷过的离心管中，加入0.1 mol/L的磷酸缓冲液，充分震荡，离心10 min(4 ℃、12 000 r/min)，取上清液，置于-20 ℃冰箱中保存，备用.

1.6.2 电泳分析

采用Bradford蛋白定量试剂盒，推算出每个样品的蛋白浓度和上样量.聚丙烯酰胺凝胶电泳开始电压为120 V，当样品进入分离胶时，将电压调为100 V. POD酶采用改良联苯胺法进行染色，SOD酶采用氮蓝四唑(NBT)法进行染色，酯酶(EST)采用醋酸-α-萘酯和坚牢蓝染色.

本实验使用凝胶成像系统(Gel Doc XR+)对实验结果进行处理，所用软件为Image Lap 4.0.1，对电泳条带进行相对定量地分析.

2 结果与分析

2.1 PEG 6 000胁迫下愈伤组织中POD酶活性的变化

采用不同质量分数PEG 6 000进行胁迫，愈伤组织中POD酶活性变化有所不同，如图1所示.

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图1 PEG 6 000胁迫下愈伤组织中POD酶活性的变化Fig.1 POD activity of callus under the stress of PEG 6 000

从图1中可以看出，在PEG 6 000质量分数为0时，POD酶的活性随着处理时间的延长基本保持不变.在PEG 6 000质量分数为0.5%～5.0%时，随着PEG 6 000质量分数的增加和胁迫时间的延长，POD酶活性升高.在PEG 6 000质量分数为0.5%～2.0%时，愈伤组织生长良好，质地紧实，呈绿色.当PEG 6 000质量分数升高到5.0%时，愈伤组织轻微白化.当PEG 6 000质量分数增加到8.0%时，POD酶活性在24 h内升高之后逐渐下降.愈伤组织白化现象加重，变软，呈现水渍状.

2.2 PEG 6 000胁迫下愈伤组织中CAT酶活性的变化

PEG 6 000质量分数不同，胁迫处理后愈伤组织中CAT酶活性变化各不相同，如图2所示.

图2 PEG 6 000胁迫下愈伤组织中CAT酶活性的变化Fig.2 CAT activity of callus under the stress of PEG 6 000

从图2中可以看出，在PEG 6 000质量分数为0时，CAT酶的活性随着处理时间的延长基本保持不变.在PEG 6 000质量分数为0.5%～5.0%时，随着PEG 6 000质量分数的增加和胁迫时间的延长，CAT酶活性升高.当PEG 6 000质量分数增加到8.0%时，CAT酶活性在24 h内升高，之后急剧下降，在处理108 h时，CAT酶活性低于20 U/g.

2.3 PEG 6 000胁迫下愈伤组织中SOD酶活性的变化

在不同质量分数PEG 6 000胁迫下SOD酶活性变化如图3.从图3可看出，在不同质量分数PEG 6 000胁迫下，SOD酶活性变化与CAT相类似.当PEG 6 000质量分数增加到8.0%时，SOD酶活性先升高，24 h之后急剧下降，在处理108 h时，SOD酶活性约为10 U/g.

图3 PEG 6 000胁迫下愈伤组织中SOD酶活性的变化Fig.3 SOD activity of callus under the stress of PEG 6 000

2.4 PEG 6 000胁迫下愈伤组织中POD同工酶的表达

在不同质量分数PEG 6 000胁迫下POD酶的酶谱如图4.

PEG 6 000质量分数分别为a．0；b．0.5%；c．1.0%；d．2.0%； e．5.0%； f．8.0%.每张图谱从左至右胁迫时间依次为0、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h.图4 PEG 6 000胁迫下愈伤组织中POD同工酶的表达Fig.4 Expression of POD isozymes under the stress of PEG 6 000

使用Image Lap4.0.1对图片进行处理，以PEG 6 000质量分数为0、胁迫0 h时的表达量定为1.00，得出所有条带的相对表达量.在PEG 6 000质量分数为0～1.0%时共检测出5条条带，且每条条带的相对表达量变化情况基本一致，说明质量分数较低的PEG 6 000胁迫作用不明显；在PEG 6 000质量分数为2.0%和5.0%时共检测出6条条带，条带4、5、6的相对表达量在0 h时分别为0.89、0.27、1.57和0.90、0.70、2.64，在108 h时分别升高为2.45、1.07、5.04和2.55、1.54、4.97；在PEG 6 000质量分数为8.0%时，条带1、2和5的相对表达量都逐渐降低，在96～108 h时不再表达.在质量分数为8.0%的PEG 6 000胁迫下，愈伤组织不能正常生长.

2.5 PEG 6 000胁迫下愈伤组织中SOD同工酶的表达

在不同质量分数PEG 6 000胁迫下SOD酶的酶谱如图5.使用Image Lap4.0.1对图片进行处理，得出所有条带的相对表达量.

PEG 6 000质量分数分别为a. 0；b．0.5%；c．1.0%；d．2.0%； e．5.0%； f．8.0%.每张图谱从左至右胁迫时间依次为0、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h.图5 PEG 6 000胁迫下愈伤组织中SOD同工酶的表达Fig.5 Expression of SOD isozymes under the stress of PEG 6 000

2.6 PEG 6 000胁迫下愈伤组织中酯酶(EST)同工酶的表达

在不同质量分数PEG 6 000胁迫下EST酶谱如图6.使用Image Lap4.0.1对图片进行处理，得出所有条带的相对表达量.

PEG 6 000质量分数分别为a． 0；b． 0.5%；c．1.0%；d．2.0%； e．5.0%； f．8.0%.每张图谱从左至右胁迫时间依次为0、12、24、36、48、60、72、84、96、108 h.图6 PEG 6 000胁迫下愈伤组织中EST同工酶的表达Fig.6 Expression of EST isozymes under the stress of PEG 6 000

从图6中可以看出，在愈伤组织中检测出2条EST同工酶条带.在不受PEG 6 000胁迫时，愈伤组织中条带1、2的相对表达量基本保持在1.00和 1.16.在PEG 6 000质量分数为0.5%～5.0%的胁迫条件下，随着胁迫时间延长和胁迫程度的加大，2条条带的相对表达量均有所升高.在PEG 6 000质量分数为8.0%时，2条条带在24 h后未检测到表达.

3 讨论

已有研究表明，环境胁迫会引起抗氧化系统酶如SOD和CAT等酶活性的改变[8-10].蔡小东等[11]研究发现，在一定质量分数范围的PEG 6 000胁迫下，随着胁迫时间的延长和胁迫程度的加大，柑橘愈伤组织中POD、SOD和CAT酶活性不断升高，在PEG 6 000质量分数为15%时，酶活性达到最大值.当PEG 6 000质量分数高于15%时，3种酶的酶活性随着PEG 6 000质量分数的升高而逐渐降低.这3种酶活性的变化趋势基本上与本研究的结果相类似.褚妍[12]研究发现，用不同质量分数的PEG 6 000胁迫处理水稻愈伤组织，SOD、POD和CAT 3种酶对PEG 6 000处理后的响应方式和响应强度都不同.

干旱胁迫对植物造成的伤害是由于活性氧的积累而导致的膜透性增加和质膜损伤，抗氧化系统酶在活性氧清除中发挥重要作用.在不同的胁迫环境下，植物愈伤组织都会有耐受极限，在一定的范围内，胁迫可以诱导愈伤组织产生过量同工酶来适应胁迫环境.反之，如果胁迫程度超出植物的耐受极限，就会使同工酶表达异常，愈伤组织不能正常生长.