云岭牛HMGA2基因InDel多态及其与生长性状的关联分析

2020-09-02李世鹏汪富文史颖超项门们雷初朝党瑞华

河北大学学报(自然科学版) 2020年4期

李世鹏，汪富文，史颖超，项门们，雷初朝，党瑞华

(西北农林科技大学动物科技学院，陕西杨凌 712100)

随着肉牛业的发展，市场对良种肉牛的需求不断提高.中国的牛品种资源丰富，但多以役用为主，且培育程度较低，为了提高肉牛的生产性能，适应社会及市场需求，中国育种工作者不断利用常规育种技术及现代生物技术等手段进行肉牛品种的选育.目前已培育出多个生产性能优异的肉牛品种，比如云岭牛、夏南牛.云岭牛作为中国第1个采用三元杂交方式培育、南方第1个拥有自主知识产权的肉用牛品种[1]，其在2014年通过了国家畜禽遗传资源委员会的现场审定[2]，2015年已经被正式定为国家畜禽新品种[3].

云岭牛是通过云南黄牛 (Yunnan Yellow)、莫累灰 (Murray Grey)和婆罗门牛 (Brahman) 杂交选育出来的[1]，具有耐热抗蜱、抗病力强、生长发育快、饲料利用率高、性成熟早、难产率低、繁殖性能好等优点.其肉口感优良，鲜嫩多汁，市场价值极高，为南方肉牛产业发展，特别是为高档雪花牛肉生产奠定了良好的种源基础[3].但是云岭牛因育成时间较短，个体间表型差异较大，仍需要在生长发育，特别是体尺性状方面继续进行系统地选育，以发挥和提高种群的生产优势.借助分子标记辅助育种技术可以加快云岭牛的选育，这对云岭牛品种的发展及其遗传资源的保护具有重要的意义.

HMG(high mobility group, HMG)蛋白由Goodwin等1973年在牛胸腺细胞中首次发现，因其在聚丙烯酰胺凝胶中具有高迁移率而得名.Bustin 将HMG 蛋白家族分为3 类：HMGA、HMGB 和HMGN，该家族成员皆有其特征性结构域，发挥着不同的作用[4].HMGA2是HMGA家族成员之一，在许多生物胚胎期及分化程度相对较低的组织中表达量高，而在高度分化的组织器官中表达量极低[5].HMGA2基因定位于人类染色体12q13-15位点上[6]，含有5个外显子和4个内含子，其中外显子Ⅰ-Ⅲ分别编码3个基本的DNA结合结构域 (AT钩) ，外显子Ⅳ编码一段含有11个特定氨基酸的序列，这个特定序列在HMGA1上是缺失的，外显子Ⅴ编码酸性的C-末端结构域，是多种磷酸化的位点[7].HMGA2蛋白本身没有转录活性，可以通过AT-hooks与DNA结合,继而改变染色质的结构，使之发生弯曲、拉伸、卷曲、成环或解链,进而影响DNA依赖的细胞核过程，比如基因的转录、复制、重组及DNA修复[8].

目前研究最多的是HMGA2基因与癌症的关系以及抗癌药物的研发，如HMGA2基因在肝癌[9]、胰腺癌[10]、结肠癌[11]、胃癌[12]、甲状腺癌[13]、卵巢癌[14]、前列腺癌[15]和胆囊腺癌[16]等癌症组织中的表达及临床意义.由于HMGA2在动物的生长发育过程中也发挥作用，是肉牛生长发育潜在的相关基因，故本实验以云岭牛为研究对象，探究HMGA2基因多态并分析其与体尺性状的关系.

1 材料和方法

1.1 实验材料

本实验以中国培育的第4个肉牛新品种云岭牛个体(共计356个)作为实验材料，样品采集于云南昆明草地动物科学研究院.每个个体采集10 mL颈静脉血样至EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)抗凝采血管中，震荡混匀后保存，保存温度-80 ℃.采集的血液样本采用全血/组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒提取血液基因组DNA，试剂盒购于天根生物科技有限公司.使用NanoDropTM1000 Spectrometer(Thermo Fisher Scientific)检测提取后的DNA质量浓度及纯度，并将其稀释到50 ng/μL，置于4 ℃下备用.

采集血样的同时对所采集的云岭牛个体进行相关体尺数据的记录，包括体高、体斜长、胸围、腹围、腰角宽、十字部高、管围、胸宽、胸深、臀围、头长、坐骨宽、额宽和尻长，以用于研究HMGA2基因的遗传突变与云岭牛体尺性状之间的关系.

1.2 引物设计

根据西北农林科技大学Animal Omics Database数据库(http://animal.nwsuaf.edu.cn)，找到牛HMGA2基因的一部分InDel位点，挑选突变可能性较高的1个潜在位点(ARS-UCD1.2 5:47872723).根据数据库信息，此位点上发生了15 bp的缺失(序列为TCCCTTTTTTGCGCC)，根据NCBI上Genebank提供的HMGA2基因序列(登录号 NC_037332.1)，利用Primer Premier5.0对该突变位点进行引物设计(表1)，由上海生工生物有限公司合成.

表1 云岭牛HMGA2基因InDel引物设计序列

1.3 PCR扩增体系及程序

引物合成完成后，取30个不同DNA样本各1 μL混合制作云岭牛的DNA池.本次实验使用12.5 μL的多聚酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增体系，体系组成为2×Taq Master Mix 6.25 μL，4.75 μL ddH2O,上游引物和下游引物各0.5 μL，模板DNA 0.5 μL.PCR扩增程序：95 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共计32个循环；72 ℃延伸10 min,产物于4 ℃保存.完成后对扩增产物使用质量分数为1%的琼脂糖凝胶电泳进行产物检测.PCR扩增产物送至上海生工生物工程股份有限公司进行测序.

1.4 Indel位点比对和验证

测序结果使用DNAstar比对分析，确定云岭牛上存在这一突变，在HMGA2基因(登录号NC_037332.1)的ARS-UCD1.2 5:47872723位置上存在15 bp的缺失，缺失序列为TCCCTTTTTTGCGCC，和预期结果相符.

1.5 聚丙烯酰胺凝胶电泳分型及基因型记录

将所有云岭牛样品分批次进行PCR扩增，PCR体系不变.扩增完毕后将产物利用质量分数10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分型(200 V，120 min).使用Excel记录所有的扩增结果的基因型.

1.6 数据统计

利用Excel等软件分析遗传多态性的指标，分别计算出基因型频率和等位基因频率.利用SHEsis在线软件检测实验所用群体是否符合哈代-温伯格平衡，使用MSRcall在线数据分析(www.msrcall.com/)进行群体遗传学参数计算.利用SPSS20.0进行基因型和体尺性状的关联性分析,分析模型为Y=μ+a+b+c,其中Y代表个体表型记录，μ代表群体均值，a代表年龄效应，b代表标记基因型效应，c代表随机误差[17].

2 结果与分析

2.1 云岭牛HMGA2突变位点分型与测序验证

将所有云岭牛样本采用质量分数10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分型，分型结果如图1.野生型(II)为315 bp条带，突变型(DD)为300 bp条带，杂合型(ID)为315 bp 条带和300 bp条带，随机各挑选1个样本测序，测序结果和聚丙烯酰胺凝胶电泳分型结果一致(图2).

图1 HMGA2基因突变区域的PCR扩增结果Fig.1 PCR amplification results of HMGA2 gene mutation region

图2 15 bp缺失纯合测序结果Fig.2 Sequencing result of 15 bp InDel

2.2 基因型频率、等位基因频率及遗传参数估计

从统计数据(表2)可知，云岭牛在InDel位点存在3种基因型，分别是II、ID、DD.其占据优势的等位基因是I. 经检验，云岭牛群体此位点不处于哈代-温伯格平衡(P<0.05).对该云岭牛群体进行遗传参数估计可知此位点多态信息含量(polymorphism information content，PIC)在0.25～0.50,属于中度多态(表3).

表2 云岭牛HMGA2基因InDel位点基因型频率和等位基因频率分布

表3 云岭牛HMGA2基因InDel位点群体遗传学参数估计

2.3 InDel位点与体尺性状的关联性分析

对云岭牛多态位点的基因型与体高、体斜长、胸围、腹围、腰角宽、十字部高、管围、胸宽、胸深、臀围、头长、坐骨宽、额宽和尻长的关联分析表明，云岭牛DD基因型的腹围显著低于II和ID基因型的腹围(P<0.05),ID和DD基因型之间差异不显著(表4).

表4 云岭牛HMGA2基因InDel位点多态性与其体尺性状关联分析

3 讨论

3.1 HMGA2基因群体遗传参数分析

通过对群体遗传参数的分析，可以检测出目标基因的遗传多样性和遗传潜力.本实验中云岭牛的有效等位基因数为1.530 4，这表明该基因多态在云岭牛群体中分布较为不均匀.PIC分析发现在云岭牛群体中该位点PIC为0.285，介于0.25～0.50，属于中度多态，说明该基因变异较大，有较大选择余地.哈代-温伯格平衡检测，发现其在云岭牛群体中不处于哈代-温伯格平衡(P<0.05)，其占据遗传优势的等位基因是I，这说明可能具有DD基因型的个体的部分经济性状较低，在人工选择过程中遭到了淘汰.这也说明了HMGA2基因对于云岭牛的生产性能可能具有重大的影响，在选育中具有参考价值.

3.2 HMGA2基因多态性与生长性状的关联分析

HMGA2基因在真核生物中大量存在，该基因转录编码含109个氨基酸的蛋白质,是高迁移率蛋白超家族的成员之一,因其分子质量小，且在凝胶电泳中迁移率高而得名.现有的大量研究发现HMGA2与人类肿瘤的发生发展密切相关，HMGA2可以结合细胞周期蛋白基因的启动子进而上调细胞周期蛋白的表达,加速细胞周期G2/M期的转化,促使肿瘤发生[18].此前已有研究表明，在胚胎发育晚期和分化完全的成熟细胞、组织中几乎测不到其转录产物,HMGA2基因功能处于失活状态[19]，但HMGA2在许多恶性肿瘤中呈高表达，HMGA2蛋白表达水平与肿瘤的恶性程度呈正相关.且已发现的所有哺乳动物的HMGA2蛋白具有同源性，它们都有相似的功能.在其他的动物如小鼠上，HMGA2的表达已被证实和骨髓间充质干细胞的更新过程[20]及精子发生过程[21]有关；在鸡的研究中，宋迟等[22]发现HMGA2在鸡的基因组中存在SNP，且与其体质量、周增质量也存在一定关系；在猪上，李平华等[23]发现HMGA2可能与耳面积有一定联系.基于上述研究，可以得知HMGA2可能和细胞分化、胚胎发育等生理过程以及肿瘤细胞的增殖转移有密切关系，据此推测HMGA2基因的表达水平可能对牛的生长发育有重要影响.在此实验中，本课题组根据西北农林科技大学Animal Omics Database数据库(http://animal.nwsuaf.edu.cn)进行了初步筛选，然后通过云岭牛混池测序，在HMGA2基因的第3内含子上发现了15 bp的缺失序列，虽然内含子并不是编码区，但是内含子会通过顺式作用元件来调节基因的转录.本研究中，将HMGA2基因的多态位点与云岭牛的生长性状进行关联性分析，发现该位点和云岭牛生长性状的腹围指标显著相关，ID与II的腹围指标显著高于DD(P<0.05).该突变可能通过增强或者抑制HMGA2基因的表达水平或者可变剪切来影响表达蛋白的能力，其作用机制有待进一步研究.