中间锦鸡儿CiCesA3的克隆及表达分析

朱宏，柴文娟，杨飞芸, 3，王瑞刚 , 3

(1. 哈尔滨师范大学 生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150080；2. 内蒙古农业大学 植物逆境生理与分子生物自治区重点实验室，内蒙古 呼和浩特 010018；3. 内蒙古自治区植物基因资源挖掘与分子育种工程技术研究中心，内蒙古 呼和浩特 010018)

植物细胞最外层透明的薄壁组织结构称为细胞壁，具有保护和支持细胞的作用.纤维素、半纤维素和果胶等是细胞壁的主要组分，纤维素是由β-1,4-葡聚糖链组成的大分子多糖类物质，是自然界中分布最广、地球上生物量最多，与人类生产生活密切相关的可再生资源[1].

纤维素主要由纤维素合酶(cellulose synthase, CesA)合成[2]，编码纤维素合酶的基因CesA在各物种中比较保守，通常包含9～13个内含子，长度为3.5～5.5 kb[1].由CesA基因所编码的纤维素合酶单体，需在高尔基体上组装成为具有对称玫瑰花环结构的纤维素合酶复合体(cellulose synthase complex, CSC)[3]，然后由分泌泡(secretory vesicles)将其转移到细胞膜上，纤维素才在细胞膜上得以生成并最终沉积到细胞壁上[4].CesA蛋白的保守结构域主要包括：负责与其他CesA单体互作的锌指/环指结构(zinc-/Ring finger motif，位于N端)、8个跨膜区(Transmembrane domains，TMD；2个在N端，6个在C端)、β-糖苷基转移酶的保守序列、D…D…D…QxxRW结构(x为任意氨基酸)、1个高度可变区和1个植物保守区域[5-7].自第1个CesA基因在木醋杆菌Bacillusxylinus中被分离发现以来[8]，得益于生物技术手段与测序技术的不断发展，越来越多的纤维素合酶基因被发现鉴定.目前，拟南芥Arabidopsisthaliana、杨树Populusalba、棉花Gossypiumherbaceum、玉米Zeamays、葡萄Vitisvinifera、水稻Oryzasativa、马尾松PinusmassonianaLamb和苎麻Boehmerianivea等40多个物种的16 400多条CesA基因序列都已被研究报道[9-10].拟南芥CesA基因家族共有10个成员，其中AtCesA1、AtCesA2、AtCesA3、AtCesA5、AtCesA6和AtCesA9参与植物细胞壁的初生壁形成时期纤维素的合成，而且已有研究表明AtCesA6和AtCesA2、AtCesA5、AtCesA9基因功能有部分冗余[11-13].次生壁纤维素的合成则由AtCesA4、AtCesA7和AtCesA8基因负责[12-14].Carroll等[15]研究发现AtCesA7基因可部分恢复cesa3突变体的初生细胞壁合成受阻的表型，表明初生壁CesA和次生壁CesA蛋白功能可以互补.

中间锦鸡儿是广泛分布于中国西北部半干旱、干旱地区的一种多年生灌木，属于豆科锦鸡儿属植物[16].近年来因其具有一定的饲用造纸等经济价值，同时也具有绿化环境、防风固沙的生态价值而受到关注.当中间锦鸡儿做造纸用时，需要其具有较高含量的纤维素；做饲料用时，考虑到动物适口性及消化等因素，则要求中间锦鸡儿纤维素含量不可过高.因此通过基因工程手段改变纤维素含量或质量成为研究热点.本研究以中间锦鸡儿为材料，通过同源克隆及RACE(rapid amplification of cDNA end)技术，从中间锦鸡儿中克隆得到CiCesA3基因全长cDNA序列，并对基因进行了生物信息学和组织表达分析，为进一步了解中间锦鸡儿纤维素合成提供了依据.

1 材料和方法

1.1 植物材料与处理方法

实验所用中间锦鸡儿种子采于内蒙古乌兰察布市四子王旗.选取生长饱满的种子播种于装有营养土和蛭石(体积比1∶3)的培养钵中，在温室中培养25 d，具体培养条件为7 000～8 000 lx光照强度、22 ℃、16 h光照/ 8 h黑暗.

选择长势良好、未受胁迫的中间锦鸡儿幼苗用于后续实验.小心从蛭石中取出中间锦鸡儿幼苗，并用清水清洗干净幼苗根部的蛭石，放于清水中，以温室培养条件培养2 d.分别剪取幼苗的根、茎、叶部分并于液氮中速冻，存于-80 ℃备用.

1.2 总RNA提取与反转录

利用TRIzol(Invitrogen公司)法进行中间锦鸡儿总RNA及根、茎、叶RNA的提取.用超微量紫外分光光度计(Quawell公司，Q5000)测定所提取的柠条总RNA及不同组织RNA的含量，并进行琼脂糖凝胶电泳，选取条带清晰且无拖带现象的RNA进行反转录.

取1 000 ng纯化过的总RNA，利用RTase M-MLV反转录酶(大连宝生物工程有限公司，TaKaRa)，依照反转录试剂说明书合成cDNA第1条链.

1.3 基因保守区克隆与cDNA末端快速扩增

根据大豆Glycinemax、杨树、棉花Gossypiumraimondii以及中间锦鸡儿中其他已知的CesA基因序列，利用Primer premier5.0软件设计简并引物(表1)，以cDNA第1条链为模板进行基因中间片段的克隆.多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)体系：10×LA PCR Buffer Ⅱ(+Mg2+)5 μL，上游(CiCesA3-jb5＇)和下游(CiCesA3-jb3＇)引物各2 μL(10 μmol/L)，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)8 μL，模板1 μL，LA Taq酶0.5 μL，无菌水31.5 μL.引物退火温度为58 ℃，PCR反应条件依照TaKaRa LA Taq®说明书(Cat#RR002B)设置.PCR反应中所用到的rTaq酶、PrimeSTAR高保真酶、LA Taq酶及Marker DL5000均购于TaKaRa.

表1 基因克隆与表达分析所用引物

通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，利用胶回收试剂盒进行PCR产物的纯化(胶回收试剂盒采购于天根生物基因技术有限责任公司).将纯化过的PCR产物与pMD19-T载体(TaKaRa)相连接，并转入大肠杆菌Escherichiacoli感受态细胞DH5α，37 ℃培养9～12 h.蓝白斑筛选后，使用移液枪挑取白色阳性克隆菌落，溶于20 μL无菌水中并吹打混匀，取5 μL上述菌液为模板进行菌落PCR.挑选成功扩增出目的基因的阳性克隆摇菌(37 ℃，200 r/min, 培养9～12 h)，取2 mL菌液送上海生工生物工程有限公司测序.

根据测序得到的部分基因序列设计RACE引物CiCesA3-rc5＇、CiCesA3-rc3＇(表1)，以中间锦鸡儿cDNA为模板进行RACE实验，具体操作按照SMARTerTM RACE cDNA Amplification kit试剂盒(TaKaRa)说明书进行.

1.4 CiCesA3基因cDNA全长克隆

将RACE得到的序列与中间保守序列进行拼接，获得CiCesA3基因全长序列，设计特异性全长引物CiCesA3-5＇和CiCesA3-3＇(表1)对拼接结果进行PCR验证.PCR反体系：5×Primer STAR buffer(+Mg2+)10 μL，上、下游引物各2 μL(10 mol/L)，模板1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，Primer STAR酶0.5 μL，无菌水补充至50 μL.引物退火温度为62.3 ℃，PCR具体反应条件根据PrimeSTAR HS DNA Polymerase说明书(Cat#R010B)设置.

1.5 CiCesA3基因组织特异性表达分析

根据CiCesA3基因cDNA序列设计qRT-PCR特异性引物(表1)，并利用SYBR@Green I荧光染料，以中间锦鸡儿幼苗的根、茎、叶cDNA为模板，在实时荧光定量PCR仪(罗氏Light Cycler480)中进行CiCesA3基因组织特异性表达分析.内参基因选择中间锦鸡儿延伸因子EF1α(elongation factor 1-alpha，EF1α).PCR具体反应体系及反应条件依照TaKaRa的SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)(Cat#RR420B).反应结束后利用2-ΔCT算法分析数据.

1.6 CiCesA3基因生物信息学分析

将基因序列输入到NCBI Blastn(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)网站搜索并比对，推测其序列的完整性.使用Vector NTI Advance@ 11.5软件拼接扩增得到的3段序列.登录ExPASy 网站后，分别利用ProtScale(http://web.expasy.org/protscale/)、ProParam(http://web.expasy.org/protparam/)工具进行预测蛋白质的亲疏水性、理论等电点与分子质量的预测.利用MEGA 5.0进化分析软件构建系统发育树.将氨基酸序列输入到HNN网站中(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa)分析蛋白质的二级结构.同时在CBS网站中，通过TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在线工具预测蛋白质跨膜结构域的数量与位置.

2 结果与分析

2.1 CiCesA3基因克隆

从NCBI中下载大豆、杨树、棉花等物种的纤维素合酶基因CesA3序列，分析这些序列的保守区域并根据保守区序列设计简并引物，以中间锦鸡儿cDNA为模板进行PCR扩增(图1a).测序结果表明扩增得到基因中间片段序列长度为2 287 bp，进一步针对该中间片段设计引物，分别进行3＇RACE和5＇RACE，电泳分别检测到约700 bp(图1b)和1 300 bp(图1c)的扩增产物.测序并将接头序列剪切后，3＇RACE和5＇RACE扩增产物长度为479 bp和1 198 bp.将扩增获得的3＇RACE、5＇RACE和中间片段进行拼接得到中间锦鸡儿CiCesA3基因.针对该基因序列设计特异性引物，以cDNA为模板，利用RT-PCR扩增验证拼接得到的全长序列(图2).测序结果表明CiCesA3基因cDNA全长为3 475 bp.

a.中间保守区域克隆；b. 3＇RACE；c.5＇RACE；M. DL 5 000分子质量标准.图1 CiCesA3基因克隆凝胶电泳分析Fig.1 Agarose gel analysis of CiCesA3 gene cloning

1，2.CiCesA3全长cDNA扩增产物；M. DL 5000分子质量标准.图2 CiCesA3基因全长cDNA扩增凝胶电泳分析Fig.2 Agarose gel analysis of CiCesA3 full-length cDNA cloning

2.2 CiCesA3基因序列分析

用ORF(open reading frame, ORF) finder分析该基因cDNA序列发现其具备完整的ORF，5＇UTR长度为175 bp，3＇UTR长度为76 bp， ORF长度为3 225 bp，编码1 075个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA(图3).将该基因序列输入到NCBI Blast中进行搜索发现，其和大豆GmCesA3基因相似度最高，故命名为CiCesA3.

小写字母表示5＇UTR和3＇UTR.图3 CiCesA3基因的cDNA及推导的氨基酸序列Fig.3 cDNA and deduced amino acid sequence of CiCesA3

2.3 CiCesA3蛋白理化性质及结构特点分析

对CiCesA3基因所推导的氨基酸序列进行分析，结果表明该蛋白质的理论等电点是6.54，分子质量约为119.89 ku.此外，利用ProtScale工具分析所推导蛋白序列的亲疏水性.正值越大说明该区域氨基酸越疏水，相反，负值越大表明该区域氨基酸越亲水.分析发现第103、104位的谷氨酰胺(Gln)和天冬酰胺(Asn)具最低分值-3.244，亲水性最强；第274位的精氨酸(Arg)则具最高分值3.2，疏水性最强.多肽链中亲水性氨基酸整体上分布较多，预示着该蛋白是亲水的.同时还预测了CiCesA3蛋白的二级结构，结果表明该蛋白二级结构中，无规则卷曲占比最大，β折叠占比最小，α螺旋位于中间(表2).

表2 CiCesA3蛋白二级结构

在TMHMM网站中预测了CiCesA3蛋白的跨膜结构域，结果显示该蛋白C端有6个跨膜区，具体氨基酸位置为851～873、885～907、922～944、970～992、1 002～1 024、1 037～1 056，此外N端第300个氨基酸位置附近也可能存在2个跨膜区(图4).

图4 CiCesA3蛋白跨膜区预测结果Fig.4 Predication of transmembrane domains of CiCesA3

2.4 CiCesA3基因的进化分析

在NCBI BlastP中输入中间锦鸡儿CiCesA3氨基酸序列并进行搜索，在搜索结果中下载拟南芥、大豆等物种的CesA序列进行多重序列比对.结果显示CiCesA3与大豆及拟南芥CesA3的氨基酸序列相似度非常高(图5)，其中，与野生大豆GsCesA3(KHN37622.1)和大豆GmCesA3(XP_003542849.1)的相似度分别达到94%和92%，与同为初生CesA蛋白的大豆GmCesA1(XP_003542849.1)的相似度也达到69%.

从Genebank中下载与CiCesA3氨基酸序列相似的其他物种的序列，采用ClustalW法进行多重序列比对，在MEGA5.0软件中进行中间锦鸡儿CiCesA3的系统进化分析(图6).分析结果表明，CiCesA3与大豆GmCesA3、野生大豆GsCesA3亲缘关系最近，相似度均达到92%以上.此外CiCesA3与同是初生壁蛋白的大豆GmCesA1、拟南芥AtCesA1的亲缘关系相对较近，序列相似度达到60%以上.而与次生壁蛋白，如野生大豆GsCesA4、GsCesA8、大豆GmCesA4、GmCesA8-like、GmCesA7、拟南芥AtCesA4、AtCesA8的亲缘关系相对较远.

图中从上至下依次为野生大豆、拟南芥、中间锦鸡儿和大豆的序列.图5 CiCesA3和其他植物CesAs氨基酸序列比对Fig.5 Alignment of amino acid sequences from CiCesA3 and other plant CesAs

采用邻接法构建系统发育树；Bootstrap 设置为1 000次.图6 CiCesA3与其他植物CesAs系统进化分析Fig.6 Phylogenetic analysis of CiCesA3 and other plant CesAs

2.5 CiCesA3基因的组织表达分析

为了探究CiCesA3基因表达的组织特异性，本研究采用实时荧光定量PCR技术检测了中间锦鸡儿幼苗根、茎、叶中CiCesA3的表达情况.结果表明该基因在根、茎、叶中均有表达，但表达量各有不同，其中，在叶中表达最高，茎中次之，根中最低，叶中的表达量是根中的7倍多(图7).

图7 CiCesA3组织特异性表达检测Fig.7 Gene expression analysis of CiCesA3 from different tissue by qRT-PCR

3 讨论

纤维素作为植物细胞壁的主要组分，对植物细胞的形态建成起着至关重要的作用.随着人类对自然资源的过度开发与利用，可再生资源的研究逐渐成为人们关注的热点，纤维素作为全球生物量巨大的可再生资源，正在被广泛研究.中间锦鸡儿不仅具有防风固沙的生态价值，还具有重要的药用、饲用及造纸价值.

本研究从中间锦鸡儿中通过同源克隆、RACE技术获得1个纤维素合酶基因——CiCesA3.序列分析表明该基因5＇UTR长为175 bp，3＇UTR长为76 bp，ORF长度为3 225 bp，编码1 075个氨基酸.CiCesA3蛋白预测分子质量为119.89 ku，是亲水性蛋白.

植物细胞壁是保护、支撑细胞的主要结构，分为初生壁和次生壁，构成细胞壁的主要化学组分是半纤维素、纤维素以及木质素.植物CesA基因常根据其表达时所具有的特定的时空性，被分为初生壁纤维素合酶基因和次生壁纤维素合酶基因[17-18].进化分析结果表明，本研究中克隆得到的CiCesA3基因与次生壁CesA亲缘关系较远，与同为初生壁CesA的AtCesA3和GmCesA3亲缘关系更近.已有研究表明纤维素合酶是具有1个催化中心和多个跨膜区的典型细胞质膜蛋白，中间锦鸡儿CiCesA3蛋白具有D…D…D…QxxRW催化中心，且蛋白N端有2个跨膜区，C端有6个跨膜区.

所有植物纤维素合酶基因都会参与纤维素的合成，同时有些家族成员还参与植物抵抗逆境胁迫的过程.由AtCesA1蛋白催化中心的1个氨基酸发生错义突变(D640N)形成的拟南芥突变体any1，表现出植株矮小、根及毛状体变少的表型，而且CSC移动速率和细胞壁结晶速度降低，但其纤维素总量和野生型并无差别[19].AtCesA3突变体mre1(G916E)植物根部细胞形状改变且细胞分裂受到抑制，导致根及下胚轴变短变粗，同时还表现出纤维素含量降低、植株矮小的表型[20].此外，在烟草中表达AtCesA3ixr1-2基因使转基因植物出现植株矮化、纤维素总量降低、次生壁纤维素杂乱沉积，同时对异恶草胺(isoxaben)耐受的表型[21].将拟南芥AtCesA6基因突变后发现，突变体植物纤维素含量降低，下胚轴和根变得又短又粗，而且植物根部皮层微管排列方向发生变化[22].二穗短柄草BrachypodiumdistachyonBdCesA4和BdCesA7基因突变后，植株变矮且开花延迟，同时细胞壁结晶纤维素合成减少，木质部和韧皮部细胞的细胞壁变薄[23].在杨树中过表达PtCesA8基因后，过表达植物出现生长停滞、枝条萎蔫、初生叶片变小、根系延伸受阻、细胞壁不规则和纤维素含量骤减等现象[24].

与拟南芥CesA1基因同源的花椰菜BrassicaoleraceaL.BoiCesA基因突变后，T3代植株叶片维管束细胞伸长不足，植物可溶性糖和脯氨酸含量升高，而且表现出比野生型更加耐盐的表型[25].拟南芥次生壁蛋白CesA4/ IRREGULAR XYLEM5 (IRX5)、 CesA7/ IRX3和CesA8/ IRX1依赖于乙烯、水杨酸和茉莉酸信号途径负调控植物抗病过程，当茄科雷尔氏菌Ralstoniasolanacearum或黄瓜枯萎菌Plectosphaerellacucumerina侵染植物后，这3个基因的突变体植株表现出比野生型更抗病的表型，但初生壁CesA蛋白(CesA1、CesA3和CesA6)并不参与这一过程[26].根据已有研究结果可推测，中间锦鸡儿CiCesA3也可能同时参与了纤维素的合成与植物抵抗非生物或生物胁迫的过程，但还需进一步地实验验证.