墨旱莲对高脂喂养小鼠肝脏脂代谢的影响

刘 幸，吴爱辉，刘云霞，史旭芹，黄美艳

(1.昆明市第三人民医院药剂科，昆明 650041；2.南京中医药大学药物分析教研室，南京210023；3.普洱市人民医院药剂科，云南普洱 665000)

随着我国经济的发展和人民生活水平的改善，居民的膳食结构发生了改变。高热量或高脂肪膳食比例逐步增加，导致了非酒精性脂肪肝的发病率逐年上升。墨旱莲(Ecliptae Herba)是菊科植物鳢肠(EcliptaprostrataL.)的干燥地上部分。2015年版《中华人民共和国药典》中记载，墨旱莲的化学成分主要包括三萜皂苷类、黄酮类、噻吩类、蟛蜞菊内酯类、挥发油和甾体生物碱等，具有滋补肝肾、凉血止血的功效。有研究显示，墨旱莲具有调节大鼠血脂的作用[1]，但并未阐述其影响肝脏脂代谢的作用机制，目前也未见墨旱莲在小鼠模型中对脂代谢影响的研究报道。本研究通过观察墨旱莲对高脂喂养C57BL/6J小鼠肝脏脂代谢相关指标的影响，以及肝脏苏木精-伊红染色(HE)切片的变化，研究墨旱莲对肝脏脂代谢的影响，以期为今后研究墨旱莲的降脂机制提供参考。

1 材 料

1.1 实验动物 SPF级C57BL/6J 雌性小鼠70只，3～4周龄，体质量(20±2) g，由昆明医科大学动物实验中心提供，实验动物合格证号：SCXK(滇)K2018-0013。

1.2 仪器和试药 CL8000全自动生化分析仪(日本岛津公司)；病理组织漂片烘片处理系统(德国Leica公司)；JEMl011透射电子显微镜(日本电子公司)；UV320紫外可见分光光度计(英国Pye-Unicam公司)。天冬氨酸转氨酶(AST)测定试剂盒(批号20180411)、丙氨酸转氨酶(ALT)测定试剂盒(批号20180411)、三酰甘油(TG)测定试剂盒(批号20180221)、总胆固醇(TC)测定试剂盒(批号20180204)、葡萄糖(Glu)测定试剂盒(批号20180617)、游离脂肪酸(FFA)测定试剂盒(批号20180316，南京建成生物技术有限公司)；墨旱莲颗粒(批号YP20161101，云南白药集团中药资源有限公司)；胆固醇(批号20180111)、胆盐(批号20180124)、羧甲基纤维素钠(CMC-Na，批号20180321)均购于国药集团化学试剂有限公司。

2 方 法

2.1 动物模型的建立和分组 70只C57BL/6J雌性小鼠适应环境3 d后进行实验，按随机数字表法随机分为5组，每组14只。对照组喂饲基础饲料，其余4组小鼠喂饲高脂饲料(含70%基础饲料，10%蔗糖，10%蛋黄粉，10%猪油)。每周记录一次体质量，喂养10周后，体质量>对照组小鼠体质量120%作为造模成功。选取48只成功造模的小鼠按体重分层随机分为4组，分别为高脂模型组，低、中、高剂量墨旱莲给药组，每组均为12只。为保证每组小鼠数量一致，对照组从中随机选取12只。对照组和高脂模型组小鼠灌胃给予1% CMC-Na胶体溶液；低、中、高剂量墨旱莲给药组小鼠分别灌胃给予40、120、360 mg/kg墨旱莲胶体溶液(按墨旱莲颗粒质量计，用1% CMC-Na溶液配制而成)，灌胃容积为10 ml/kg，每日一次，连续6周。给药期间对照组喂饲基础饲料，高脂模型组和墨旱莲给药组喂饲高脂饲料。实验期间各组小鼠均可自由进食与饮水，保持室温20～24 ℃，相对湿度40%～70%，光照周期为12 h昼/12 h夜，每周称量体质量1次。饲养周期为6周。

2.2 指标测定和样本采集 最后一天给药结束后禁食12 h，于小鼠内眦取血，1×103×g离心10 min分离血清，用全自动生化仪测定各组小鼠血清中TG、TC、Glu、AST、ALT水平。打开小鼠腹腔，取肝脏、腹部及肾周脂肪，称重并计算肝脏重量与体质量比值、脂肪重量与体质量比值。取肝脏组织，制作HE切片，于透射电子显微镜下观察小鼠肝细胞的空泡数量、损失的弹性纤维、脂肪沉积和肝细胞的水样变性水平等肝组织形态学变化并拍照。另取100 mg肝脏组织，用生理盐水制成20%组织匀浆，3×103×g离心15 min，取上清液，按试剂盒说明书用UV320紫外可见分光光度计测定FFA含量。

3 结 果

3.1 墨旱莲对小鼠体质量、体长、Lee’s指数和BMI的影响 给药2周后，与对照组比较，高脂模型组小鼠体质量、Lee’s指数和BMI均显著升高(P<0.05)；与高脂模型组比较，低、中、高剂量墨旱莲给药组小鼠体质量、体长、Lee’s指数、BMI无显著性差异(P>0.05)，墨旱莲各给药组组间比较亦无显著性差异(P>0.05)。给药6周后，与对照组比较，高脂模型组小鼠体质量、Lee’s指数和BMI均显著升高(P<0.05)；与高脂模型组比较，中、高剂量墨旱莲给药组小鼠体质量、Lee’s指数和BMI均显著降低(P<0.05)，墨旱莲各给药组组间比较无显著性差异(P>0.05)，见表1。表明墨旱莲能够缓慢、有效地减轻高脂喂养小鼠的体质量。

表1 各组小鼠体质量、体长、Lee’s指数和BMI的比较Table 1 Comparison of the body weight,body length,Lee’s index and BMI of the mice in each group

3.2 墨旱莲对小鼠肝脏、腹部及肾周脂肪重量的影响 给药6周后，与对照组比较，高脂模型组小鼠肝脏重量、肝脏重量与体质量比值、腹部及肾周脂肪重量、脂肪重量与体质量比值均有显著改变(P<0.05)；与高脂模型组比较，中、高剂量墨旱莲给药组小鼠腹部及肾周脂肪重量、脂肪重量与体质量比值显著降低(P<0.05)，见表2。由表2可见，墨旱莲降低腹部及肾周脂肪重量具有明显优势。

表2 给药6周后各组小鼠的肝脏重量、肝脏重量与体质量比值、腹部及肾周脂肪重量、脂肪重量与体质量比值Table 2 Liver weight,liver weight/body weight ratio,fat weight,abdominal and perirenal fat weight/body weight ratio of the mice in each group after 6 weeks of medication

3.3 墨旱莲对小鼠肝脏组织形态学的影响 给药6周后，观察小鼠肝组织形态学变化(见图1)。由图1可见，对照组小鼠肝细胞形态规整，胞质均匀，胞核清晰，细胞大小一致，细胞间分界清楚，无病变、脂肪滴和炎性浸润。高脂模型组小鼠肝细胞排列不规则，有大量的脂肪空泡，细胞质、细胞核多消失，肝细胞呈片状死亡。与高脂模型组比较，高剂量墨旱莲给药组小鼠肝组织细胞质、细胞核清晰可见，肝脏组织中脂肪滴明显减少，空泡样变性和细胞坏死较少，肝细胞受损情况显著好转，表明高剂量墨旱莲预防和改善高脂喂养小鼠肝脏脂肪变性的效果更佳。墨旱莲低、中剂量给药组与高脂模型组比较无明显差异。

3.4 墨旱莲对小鼠血清各项生化指标的影响 给药6周后，与对照组比较，高脂模型组小鼠血清TC、TG水平显著升高(P<0.05)。与高脂模型组比较，高剂量墨旱莲给药组小鼠血清TC、TG水平显著降低(P<0.05)，而低、中剂量墨旱莲给药组小鼠血清各项生化指标均无明显变化(P>0.05)。小鼠肝脏FFA含量在对照组中最低，在高脂模型组中最高，高、中、低剂量墨旱莲给药组次之，但各组间比较均无统计学差异(P>0.05)，见表3。由表3可见，墨旱莲早期对肝功能和糖原影响较小，但可启动降脂机制，墨旱莲对肝脏脂肪变性的预防和保护作用主要是通过降低TC、TG来实现的。

表3 给药6周后各组小鼠血清生化指标的变化Table 3 Changes in serum biochemical indexes of the mice in each group after 6 weeks of medication

4 讨 论

高脂血症是由于脂质代谢紊乱引起的，可引起脂肪肝、动脉粥样硬化等疾病。血脂升高主要有以下几方面的原因：(1)肝细胞转载TG的能力降低[3]；(2)低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor，LDLR)的活性降低，引起胆固醇的蓄积[3]；(3)脂质过氧化反应增加[4]；(4)FFA对肝细胞的损伤[5]等。

墨旱莲的降脂作用机制是抑制胆固醇的合成还是促进肝脏的脂质代谢，目前仍无定论。本研究结果显示，高剂量墨旱莲给药组小鼠的TC和TG水平均显著降低(P<0.05)，说明墨旱莲对肝脏脂肪变性的保护作用可能是通过降低TC和TG水平来实现的，这与墨旱莲可调节大鼠血脂的研究结果一致[1]。另一方面，墨旱莲乙醇提取物可提高血清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)的活性，降低高脂血症小鼠肝组织中的丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量[6]，降低3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methylglutary CoA reductase，HMGR)的表达。HMGR是胆固醇生物合成中的关键酶，通过下调HMGR的表达可抑制胆固醇的生成，还能增加肝脏过氧化物酶增殖体激活受体α(PPARα)和LDLR mRNA的表达水平。PPARα可通过调节脂质代谢和脂肪酸代谢相关蛋白基因的表达，从而改善动脉粥样硬化。LDLR可清除肝脏循环中的低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)；增加卵磷脂胆固醇脂酰转移酶(lecithin-cholesterol transferase，LCAT)和B类Ⅰ型清道夫受体(scavenger receptor class B type Ⅰ receptor，SR-B1) 的表达，LCAT可将胆固醇转化成胆固醇酯，并在胆固醇逆向转运的过程中发挥作用[7]，SR-B1是高密度脂蛋白(high density lipoprotein，HDL)的受体，能够介导HDL胆固醇酯的选择性吸收，可参与胆固醇的逆向转运[8]。这些说明墨旱莲加速脂质代谢的作用可能与胆固醇的逆向转运有关，以及与肝脏脂质代谢和脂肪酸氧化相关受体的上调有一定的关系，如PPARα、LDLR、LCAT和SR-BI等受体。

墨旱莲的保肝作用可能与其黄酮类成分有关，墨旱莲中的黄酮类成分含有丰富的酚羟基，具有较强的抗氧化作用，推测其具有保肝作用[9]，可对抗FFA对肝细胞的损伤。高脂血症可导致肝脏中活性氧自由基和脂质过氧化水平增加。墨旱莲中的蟛蜞菊内酯成分可以通过清除氧自由基，减少脂质的过氧化反应，从而降低氧自由基对肝细胞的损害[10]。倪鸿昌等[11]的研究显示，继续给予高脂血症模型大鼠高脂喂养后，肝脏可出现明显的炎性病变，肝功能有不同程度的损害，肝组织匀浆中MDA显著升高，目前认为MDA在肝组织脂肪变和肝损伤方面起重要作用。石变华等[6]的研究也指出，墨旱莲水煎剂可以提高肝脏组织中SOD的活性，降低MDA含量，并呈剂量依赖性，从而延缓肝脏的衰老。在ZHAO等[7]的研究中，利用仓鼠建立高脂模型，仓鼠的肝细胞受损后，喂养70%乙醇提取的墨旱莲，结果显示墨旱莲可显著降低LDL水平，减少脂质的合成和释放，促进血浆中脂质的清除。但本研究中的小鼠并未出现明显的肝功能异常，而且与高脂模型组比较，低、中、高剂量墨旱莲给药组均未发现肝脏组织中FFA的含量有显著性降低，这可能与本研究中小鼠的肝功能未发生显著异常有关，也可能与小鼠喂养周期的长短有关。

本研究结果表明，墨旱莲具有显著的降脂作用，但由于本研究未测定小鼠肝脏组织中MDA和SOD的含量，故不能有效评价墨旱莲的保肝作用。在后期的研究中，将增加更多的生化指标，为墨旱莲在肝脏脂代谢方面的研究提供更多的参考数据。