硫酸氢氯吡格雷固体分散体的制备及生物相关性体外评价

王众勤，卢恩先，沈 琦

(1.上海交通大学药学院，上海 200240；2.上海奥科达生物医药科技有限公司研发部，上海 201318)

口服难溶性药物的生物利用度取决于药物自身的溶解度和溶解状态的维持时间，而其溶解状态的维持时间是药物起效的关键因素。目前已有多种提高难溶性药物溶解度的方法，如减小粒径，加入表面活性剂，或者制成包合物、固体分散体、多晶型物、溶剂化物、前药、微粒(脂质体、微球、纳米粒)等新剂型。在这些新剂型的药物中，无定形或亚稳态晶型、弱碱、晶盐或共晶型药物可形成过饱和制剂[1]。弱碱性药物因其本身特性和胃肠道生理特性，在胃中已经溶解的药液进入小肠时可能出现沉淀，进而导致药物吸收变异大并影响体内行为的预测。而常规的体外评价方法不能预测这类药物的体内行为，需要模拟实际生理条件来进行实验[[2-3]。硫酸氢氯吡格雷是弱碱性药物，在生物药剂学分类系统中属于Ⅱ类药物，即具有低溶解性和高渗透性。硫酸氢氯吡格雷易溶于pH 1的溶液，在近中性、中性或碱性介质中不溶，因此该药在胃中能够充分溶解，但是进入到肠道后因pH变化，溶解度下降而析出沉淀。本研究采用不同工艺制备硫酸氢氯吡格雷固体分散体，用差示扫描量热法和X射线衍射法对固体分散体的晶体形态进行检测，并用具有生物相关性的两单元介质转运法来评价其溶出特性，以提高药物在生理pH环境下的溶解性。

1 仪器和试药

1.1 仪器 EYELA N-1100旋转蒸发仪(日本东京理化器械株式会社)；B-290/B-295喷雾干燥机(瑞士BÜCHI公司)；Process 11热熔挤出机(美国ThermoFisher Scientific公司);RCZ-8M溶出仪(天津天大天发科技有限公司)；Bruker D8 Advance粉末衍射仪(德国Bruker有限公司)；Q1000差示扫描量热仪(德国TA通用仪器公司)；UV 2400PC紫外可见分光光度计(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；KBF240型恒温恒湿箱(德国Binder公司)。

1.2 药品和试剂 硫酸氢氯吡格雷(含量99%，湖北康宝泰精细化工有限公司，批号170415)；Soluplus(德国BASF公司，批号84414368E0)；水为蒸馏水(屈臣氏集团公司)。

2 方法和结果

2.1 硫酸氢氯吡格雷含量测定方法的建立

2.1.1 标准曲线的建立 取硫酸氢氯吡格雷原料药适量，以50%甲醇水溶液(V/V)稀释，配制成系列浓度(10.024、20.048、40.096、60.144、80.192、100.240 μg/ml)的标准曲线工作液，用紫外可见分光光度计于240 nm处测定吸光度。以硫酸氢氯吡格雷的吸光度(A)对浓度(c)做线性回归，得到标准曲线方程为A=0.015 3c+0.020 8(r=0.999 8)，表明硫酸氢氯吡格雷在10.024～100.240 μg/ml浓度范围内有良好的线性关系。

2.1.2 精密度实验 精密称取适量的硫酸氢氯吡格雷原料药，加20 ml甲醇溶解，分别用pH 2.0的盐酸溶液和pH 6.8的磷酸盐缓冲液稀释，制成20 μg/ml的溶液，用紫外可见分光光度计于240 nm处测定吸光度，平行测定6次。结果测得pH 2.0的盐酸溶液中6份样品含量的RSD为0.57%，pH 6.8的磷酸盐缓冲液中6份样品含量的RSD为0.47%(n=6)。结果表明，该含量测定方法的精密度符合规定。

2.1.3 回收率实验 取硫酸氢氯吡格雷原料药适量，以50%甲醇水溶液(V/V)稀释，配制成低、中、高浓度(10.024、40.096、80.192 μg/ml)的样品溶液各3份，用紫外可见分光光度计于240 nm处测定吸光度，根据标准曲线计算回收率。结果低、中、高浓度溶液中硫酸氢氯吡格雷的回收率分别为(100.33±1.65)%、(98.49±0.59)%和(101.33±0.80)%(n=3)。结果表明，该含量测定方法的回收率符合规定。

2.2 物理混合物和固体分散体的制备

2.2.1 物理混合物的制备 称取硫酸氢氯吡格雷原料药和载体Soluplus，按1∶1(w/w)混合均匀，过60目筛，即得物理混合物，备用。

2.2.2 固体分散体的制备 (1)溶剂蒸发法：取2.2.1项下的物理混合物粉末，加入适量乙醇溶解，将充分溶解的溶液转移至旋转蒸发仪中，设定温度为60 ℃，抽真空。待溶剂蒸干后，收集蒸馏瓶中的固体，置真空干燥器中干燥48 h。将干燥后的固体粉碎，过60目筛，即得硫酸氢氯吡格雷固体分散体。(2)喷雾干燥法：取2.2.1项下的物理混合物粉末，加入适量乙醇充分溶解。设定进风温度为80 ℃，抽气为100%，Q-flow球调节至40 mm，将含药乙醇溶液以8 ml/min速度泵入喷雾干燥机中，此时出风温度控制在约46 ℃。收集喷干后的固体，置真空干燥器中干燥48 h。将干燥后的固体粉碎，过60目筛，即得硫酸氢氯吡格雷固体分散体。(3)热熔制粒法：由于Soluplus的玻璃态转化温度为70 ℃，故设定自进料口至出料口各区段的温度分别为60 ℃、80 ℃、100 ℃、100 ℃、90 ℃、70 ℃、60 ℃和30 ℃，螺杆转速为30 r/min，扭矩为60%～80%。将制得的颗粒冷却至室温后粉碎，过60目筛，即得硫酸氢氯吡格雷固体分散体。(4)热熔挤出法：由于硫酸氢氯吡格雷原料药的熔点约为180 ℃，故设定自进料口至出料口各区段的温度分别为140 ℃、155 ℃、170 ℃、180 ℃、185 ℃、170 ℃、150 ℃和140 ℃，螺杆转速为50～70 r/min，扭矩为30%～40%，挤出模孔为2 mm。将挤出的条状物冷却至室温后粉碎，过60目筛，即得硫酸氢氯吡格雷固体分散体。

2.3 固体分散体溶解度的测定 (1)物理混合物的溶解度：称取过量的硫酸氢氯吡格雷原料药粉末，分别溶于10 ml的pH 2.0盐酸溶液、pH 3.0盐酸溶液、pH 4.0柠檬酸盐溶液、pH 5.0柠檬酸盐溶液、pH 6.0磷酸盐缓冲液、pH 6.8磷酸盐缓冲液中。结果物理混合物中硫酸氢氯吡格雷原料药在pH 2.0、pH 3.0、pH 4.0、pH 5.0、pH 6.0和pH 6.8介质中的溶解度分别为>10 mg/ml，(1.657±0.022)、(0.134±0.011)、(0.036±0.004)、(0.018±0.008)和(0.010±0.003) mg/ml。由此可见，硫酸氢氯吡格雷原料药在不同pH的介质中溶解度不同，随着pH值增加，溶解度大幅下降，这是弱碱性药物的基本特性。(2)固体分散体的溶解度：称取各工艺制备的过量硫酸氢氯吡格雷固体分散体及2.2.1项下的物理混合物，分别溶于10 ml的pH 6.8磷酸盐缓冲液中，确保溶液中有未溶解的固体。振摇48 h后，以相对离心力1.073×103×g离心15 min，取上清液适当稀释后，用紫外可见分光光度计在240 nm处测定吸光度[[4-5]，据此计算溶解度。结果溶剂蒸发法、喷雾干燥法、热熔制粒法和热熔挤出法制备的硫酸氢氯吡格雷固体分散体在pH 6.8介质中的溶解度分别为(0.275±0.009)、(0.268±0.002)、(0.245±0.011)和(0.278±0.009) mg/ml，物理混合物在pH 6.8介质中的溶解度为(0.233 ± 0.012) mg/ml。与硫酸氢氯吡格雷原料药相比，物理混合物在pH 6.8介质中的溶解度明显增加，提高至约20倍，表明载体Soluplus对硫酸氢氯吡格雷具有明显的增溶效果。物理混合物在pH 6.8介质中的溶解度略低于各工艺制备的固体分散体，而各工艺制备的固体分散体的溶解度之间无显著性差异。

2.4 固体分散体晶型的测定

2.4.1 X射线衍射分析 取适量硫酸氢氯吡格雷固体分散体、硫酸氢氯吡格雷原料药、载体Soluplus以及物理混合物，分别装入X射线衍射仪的样品皿中。设定条件为：Cu靶，40 kV，电流40 mA，扫描范围3°～40°，步宽0.02°，扫描速度为0.2 s/步，绘制X射线衍射图，见图1。由图1可见，硫酸氢氯吡格雷原料药的X射线衍射图存在明显的特征衍射峰，载体材料未见明显衍射峰；在物理混合物和热熔制粒法制备的固体分散体中，硫酸氢氯吡格雷所有的衍射峰均有显现，表明在物理混合物和热熔制粒法制备的固体分散体中硫酸氢氯吡格雷是以晶体存在的。而溶剂蒸发法、热熔挤出法和喷雾干燥法制备的固体分散体的X射线衍射图中该特征峰消失，表明其中的硫酸氢氯吡格雷与载体形成无定形结构。

2.4.2 差示扫描量热分析 分别取适量各工艺制备的硫酸氢氯吡格雷固体分散体、硫酸氢氯吡格雷原料药、载体Soluplus以及物理混合物，分别置于差示扫描量热仪的铝坩埚内，以空铝坩埚为参比，以10 ℃/min的速率升温，温度扫描范围为40 ℃～200 ℃，氮气流速50 ml/min，得到差示扫描量热分析图见图2。由图2可见，硫酸氢氯吡格雷原料药和物理混合物在180 ℃有特征吸收峰。将图2中3、4、5、6、7保持横坐标不变，纵坐标放大10倍，发现热熔制粒法制备的固体分散体的差示扫描量热分析图在约160 ℃有一个较小的特征吸收峰(见图3)，而喷雾干燥法、溶剂蒸发法和热熔挤出法制备的固体分散体并没有该特征吸收峰。因此，进一步验证了以热熔制粒法制备的固体分散体中的硫酸氢氯吡格雷是以晶体形态分散在Soluplus中，而在喷雾干燥法、溶剂蒸发法和热熔挤出法制备的固体分散体中，硫酸氢氯吡格雷与Soluplus形成了无定形结构。

2.5 固体分散体过饱和溶解的测定 采用两单元介质转运法测定不同工艺制备的固体分散体的溶解度[6]。分别精密称取300 mg硫酸氢氯吡格雷原料药及含等量硫酸氢氯吡格雷的固体分散体，分别采用两单元介质转运法检测硫酸氢氯吡格雷的溶解状态及析出情况。参照《中华人民共和国药典》2015年版第四部附录0931第二法(桨法)，设置转速为50 r/min，介质温度(37±0.5) ℃。在开始的5 min内，先将样品溶解于盛有300 ml的pH 2.0盐酸溶液的溶出杯中(相当于胃单元)，然后模拟胃排空过程，将溶液以5 或10 ml/min速度泵入盛有300 ml的pH 6.8磷酸盐缓冲液的溶出杯中(相当于肠单元)，60或30 min后泵完，最终介质为600 ml的pH 6.52的混合溶液。在5、15、30、40、50、60、90、120、180 min 分别从pH 6.8磷酸盐缓冲液中取样4 ml，同时补充4 ml相同的介质，滤过，弃去2 ml初滤液，取1 ml续滤液置试管中，用乙醇稀释至2倍体积，涡旋混匀，作为供试品溶液。用紫外可见分光光度计于240 nm处测定吸光度，计算溶解量，绘制溶出曲线(见图4和图5)。由图4可见，在泵速为5 ml/min时，热熔制粒法、热熔挤出法和喷雾干燥法制备的固体分散体在pH 6.8介质中的溶解量远高于溶剂蒸发法制备的固体分散体，并且几乎相当于完全溶解的投药量。溶剂蒸发法制备的固体分散体虽未能全部溶解，有部分药物析出，但其溶解量仍优于物理混合物。在泵速为10 ml/min时，热熔制粒法、热熔挤出法和喷雾干燥法制备的固体分散体在pH 6.8介质中的溶解量虽然高于溶剂蒸发法制备的固体分散体，但是与泵速5 ml/min相比，最终溶解量有所下降，意味着有少量药物析出；而溶剂蒸发法制备的固体分散体在泵速10 ml/min时的最终溶解量有所上升。因此，后续实验选择泵速为5 ml/min。

2.6 稳定性实验 热熔制粒法制备的固体分散体中，原料药大部分以固体晶型存在，制备过程中物料与螺杆之间存在较大的摩擦力，导致工艺不顺畅，不具有连续生产的可行性；溶剂蒸发法制备的固体分散体在pH 6.8介质中的最终溶解量相对更低。因此，结合制备工艺的实际操作性及溶解量评价结果，仅选取喷雾干燥法和热熔挤出法制备的固体分散体进行稳定性实验。取喷雾干燥法和热熔挤出法制备的固体分散体适量，用铝箔袋密封，置于25 ℃且相对湿度65%的恒温恒湿箱中，放置6个月后，测定X射线衍射图和差示扫描量热分析图，检查其无定形稳定性情况(见图6和图7)。热熔挤出法制备的固体分散体，初始时X射线衍射图谱上无特征峰，差示扫描量热图谱上无吸收峰；在25 °C且相对湿度60%条件下放置6个月后，X射线衍射图谱上出现特征峰，并且差示扫描量热分析图谱上出现吸收峰，表明热熔挤出法制备的固体分散体在储存的过程中由无定形转变为晶型，不稳定。而喷雾干燥法制备的固体分散体在初始条件和25 °C、相对湿度60%条件下放置6个月，X射线衍射图谱上均无特征峰显现，差示扫描量热分析图谱上均无吸收峰，表明喷雾干燥法制备的固体分散体稳定，在室温条件下放置6个月内未发生晶型变化。因此，确定喷雾干燥法为生产硫酸氢氯吡格雷固体分散体的最优工艺。

3 讨 论

3.1 辅料种类及比例的确定 本研究为固体分散体选取的载体材料为Soluplus，其安全性高，被美国药典、欧洲药典等收录，有较低的临界胶束浓度，具有增溶、抑制晶体析出、空间稳定、助悬、热敏、成膜等特性，可广泛用于制备固体分散体[7-8]。一般来说，载体的用量越大，抑制药物析出效果越显著，维持过饱和状态越好。考虑到载药量，并且需要为后续添加其他辅料留有空间，以及便于不同工艺制备的固体分散体之间的对比，故选择硫酸氢氯吡格雷原料药与Soluplus的比例为1∶1(w/w)。

3.2 泵速的选择 由于硫酸氢氯吡格雷为弱碱性药物，在胃液中完全溶解后，以溶液形式进入小肠，将药物以溶液的形式泵入pH 6.8的磷酸盐缓冲液与药物在体内的过程一致，因此考察药物在pH 6.8介质中的溶解情况及持续时间，可以初步判断药物在体内的实际吸收情况。考察介质转运速度时，将泵速设定为5 ml/min，是根据人体空腹时胃完全排空需要的时间约为1 h确定的[9]。300 ml溶液在60 min内转移完，故介质的转运速度为5 ml/min。选取含300 mg硫酸氢氯吡格雷的固体分散体进行投药，其在600 ml的pH 6.8介质中完全溶解时终浓度为0.5 mg/ml，超出固体分散体的溶解度，以此评估不同工艺制备的硫酸氢氯吡格雷固体分散体在pH 6.8介质中维持过饱和的能力。物理混合物的最终溶解量约占投药量的40%，此时的药物浓度约为0.2 mg/ml，等于其溶解度。对于热熔制粒法、热熔挤出法和喷雾干燥法制备的固体分散体，将溶解的药物泵入pH 6.8的磷酸盐缓冲液的时间较长，过饱和状态增加的速度和程度较慢，整个溶出过程也仅为3 h。分析原因是载体与硫酸氢氯吡格雷原料药分子间有紧密包合的相互作用力，加上Soluplus具有优良的抑制药物析出和维持过饱和能力，使固体分散体的药物溶液在泵入的过程中均为溶解状态，并且泵入后仍能维持过饱和状态，所以最终溶解量大于溶解度。而溶剂蒸发法制备的固体分散体，因载体与药物分子相互作用不强，维持过饱和能力较弱，有药物析出，所以最终溶解量略高于溶解度。考虑到在特殊情况下，胃排空时间可能会缩短，将泵速调整为10 ml/min，即30 min内排空300 ml溶液。当泵速为10 ml/min时，泵入时间缩短，过饱和程度提高得较快，各工艺制备的固体分散体的溶解趋势也发生一定变化。热熔挤出法、热熔制粒法和喷雾干燥法制备的固体分散体，随着泵速加快，出现少量药物析出，泵入量要远大于析出量，故整体仍呈快速上升趋势，但是药物最终溶解量较泵速为5 ml/min时略低。对于溶剂蒸发法，将泵速提高为10 mg/min时，药物泵入速度的增加大于析出速度的增加，且排空时间缩短，沉淀时间也相对缩短，所以药物溶解量整体也呈上升趋势，并且最终溶解量比泵速5 ml/min时更多。此时溶剂蒸发法制备的固体分散体与热熔制粒法、热熔挤出法、喷雾干燥法制备的固体分散体在pH 6.8介质中的药物溶解量之差减小，区分力减弱，因此泵速是区分溶剂蒸发法与其他工艺制备的固体分散体的关键因素。这可能意味着当胃排空速度发生变化时，各工艺制备的固体分散体的体内吸收情况也会不同，进一步证实了两单元介质转运法具有生物相关性和区分力。

3.3 不同工艺制备的固体分散体中分子相互作用机制 溶剂蒸发法在制备硫酸氢氯吡格雷固体分散体时，由于溶剂缓慢蒸发，固体逐渐析出，在这个缓慢过程中，溶剂中的乙醇分子可影响硫酸氢氯吡格雷分子与载体分子之间的结合和作用，硫酸氢氯吡格雷原料药被Soluplus包裹得不紧密，因此在pH 6.8介质中的最终溶解量只是略高于物理混合物。而喷雾干燥法制备硫酸氢氯吡格雷固体分散体时，溶剂瞬间干燥，Soluplus与硫酸氢氯吡格雷原料药分子之间的乙醇分子迅速蒸发，两者迅速聚拢、相互包裹、紧密结合，所以在药物泵入后仍能保持溶解状态，维持较高的过饱和度。热熔挤出法和热熔制粒法制备的硫酸氢氯吡格雷固体分散体中，只有硫酸氢氯吡格雷原料药与Soluplus两种分子相互作用，且Soluplus为液态，硫酸氢氯吡格雷原料药能更好地分散在载体分子中，并与载体相互作用。因此，虽然溶剂蒸发法制备的固体分散体为无定形状态，但其在pH 6.8介质中抑制药物析出和维持药物过饱和状态的能力要低于热熔挤出法和喷雾干燥法制备的固体分散体，甚至还低于热熔制粒法制备的晶体状态的固体分散体。由于泵速相同，虽然在热熔制粒法制备的固体分散体中，药物以晶体形态分散，但是在泵入的过程中一直处于溶解状态且未析出，所以其固体分散体在pH 6.8介质中的溶解量占投药量的百分比随时间的变化趋势与喷雾干燥法和热熔挤出法制备的固体分散体相近，维持过饱和能力相当，最终溶解量也就相同。这也说明固体分散体的溶解情况和药物过饱和状态的维持除了与药物的晶体形态相关外，还与制备时载体与药物的结合情况相关。载体与药物的结合情况会影响药物与载体的相互作用，从而也会影响药物的溶解状态和维持过饱和状态的能力。各种工艺制备的固体分散体中药物与载体分子微观结构示意图猜想见图8。

3.4 总结和展望 对不同工艺制备的硫酸氢氯吡格雷固体分散体做对比和评价可知，以热熔制粒法制备固体分散体时，原料药未熔融，除了少量药物分子溶于液态的载体内，大部分药物仍以固体粉末形式存在。故制备过程中，物料与螺杆之间存在较大的摩擦力，虽然转速小于热熔挤出法，但螺杆间扭矩大，工艺不顺畅，不具有连续生产的可行性。溶剂蒸发法制得的固体分散体在pH 6.8磷酸盐缓冲液中的溶解量和过饱和状态低于喷雾干燥法和热熔挤出法制备的固体分散体。而热熔挤出法制备的固体分散体在储存的过程中会从无定形转变为晶型，不稳定。综上所述，确定喷雾干燥法为生产硫酸氢氯吡格雷固体分散体的最优工艺。

本研究采用生物相关性的两单元介质转运法对不同工艺制备的硫酸氢氯吡格雷固体分散体的溶解状态及析出情况进行了考察。该方法基于生理环境而设计，两单元分别代表药物崩散、溶解的胃室和药物溶出、吸收的肠室，很好地模拟了药液在胃肠道转运过程中的pH值变化对药物溶解及吸收的影响。两单元介质转运法中，泵速是关键影响因素，保持5 ml/min的泵速具有较好的区分性。虽然不同工艺制备的固体分散体的溶解度与物理混合物无明显差异，但采用该方法可区分不同工艺制备的固体分散体之间的差异。两单元介质转运法也可用于其他弱碱类药物的过饱和状态特性评价。