纤溶酶原激活物抑制剂-1(4G/5G)基因多态性与深静脉血栓事件的风险概率

张莹，程晓东，胡玉皎，王昊，周铁成，郝晓柯，刘家云(空军军医大学第一附属医院检验科，西安 710032)

目前研究证实，纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI-1)是内皮细胞型纤溶酶原激活抑制剂，属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，其主要功能为灭活组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)，调节机体纤溶系统活性。PAI-1含量或活性增加可降低纤溶活性，促进血栓形成和复发[1]。PAI-1(4G/5G)基因启动子区单核苷酸插入/缺失基因多态性与血浆PAI-1活性有关。对于PAI-1(4G/5G)基因，4G等位基因附近仅有转录激活物作用位点，而5G等位基因附近不仅有转录激活物作用位点, 还有转录抑制物作用位点，4G等位基因的活性要高于5G等位基因，并且4G等位基因和PAI-1基因的表达水平之间具有较强的相关性，4G基因携带者会增加血栓形成及复发的风险。研究发现，由于PAI-1(4G/5G)基因是纤溶酶原激活物抑制剂的效应分子，故而其突变与心脑血管疾病的发生有关[2]，亦与深静脉血栓的形成有关[3]。本研究使用数字荧光染色原位杂交技术检测PAI-1(4G/5G)基因位点，为携带PAI-1(4G/5G)基因4G4G型的人群预防静脉血栓、脑卒中等血液高凝状态风险的发生提供实验依据。

1 材料与方法

1.1研究对象 收集2017年2月至2019年12月在我院进行PAI-1(4G/5G) 基因位点检测的人群1 494例，男792例，女702例，年龄(41.1±15.0)岁。其中体检健康者336例，男267例，女69例，年龄(50.8±8.6)岁，剖腹产患者401例，年龄(31.9±5.6)岁，烧伤手术患者603例，男424例，女179例，年龄(39.5±18.4)岁，心脑血管疾病手术患者154例，男101例，女53例，年龄(50.2±10.9)岁。

1.2试剂和仪器 TL998A荧光检测仪(西安天隆科技公司)。10×NH4Cl预处理液、耀金保(核酸纯化试剂)、耀金分(测序反应通用试剂盒)、软件设定液、阳性对照均购自北京华夏时代基因科技发展公司。

1.3样本收集 采集各研究对象就诊时(体检健康者于体检时采集)的静脉血标本2～3 mL，EDTA-K2抗凝，置于4 ℃保存，保存时间不超过24 h。

1.4标本前处理 在1.5 mL离心管中加入1.0 mL 1×NH4Cl预处理液，吸取200 μL混匀的全血标本，室温静置5 min，待红细胞完全破裂后，(1 000～1 200)×g离心5 min。将上层透明红色液体吸弃，向管底富集的白细胞团块中加入30 μL耀金保使白细胞的胞膜破裂。充分混匀，室温静置30～60 min，用于后续实验。

1.5方法

1.5.1样本检测 吸取1.5 μL处理后的白细胞样本加入至含有PAI-1(4G/5G)试剂的子弹头中，然后将子弹头装载到TL998A荧光检测仪上运行试验，仪器运行50个裂解循环后，根据达到设定的荧光信号阈值时的循环次数判读结果。

1.5.2阳性对照检测 吸取1.5 μL的阳性质控品，加入至对应的试剂中上机检测，阳性对照用以监测实验能否正常检出阳性标本，检出结果应为阳性质控品的基因型。

1.5.3阴性对照检测 吸取1.5 μL耀金保保存液，加入至试剂中上机检测，阴性对照用以监测实验室和前处理过程中是否存在污染，检出结果应为“重测”。

1.6血栓评估方法 追踪200例病情相近的烧伤手术患者，术后2个月的治疗期内定期检测深静脉超声的影像结果，通过管腔内是否有异物或者血流是否正常充盈等指标判断患者从患病开始至患病后2个月内深静脉血栓事件的发生情况。

1.7统计学分析 采用SPSS 19.0统计学软件进行分析处理，数值变量资料均进行正态性检验，分类变量资料组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1PAI-1(4G/5G)基因的分布情况PAI-1(4G/5G)基因多态性在体检健康者、剖腹产患者、烧伤患者、心脑血管疾病患者中的分布情况见表1。

表1PAI-1(4G/5G)基因型在不同人群中的分布[n(%)]

2.2PAI-1(4G/5G)基因风险比分布情况 对于PAI-1(4G/5G)基因，4G4G和4G5G基因型患者与5G5G基因型患者相比，发生静脉血栓的风险比OR(95%CI)分别为6.35(2.5～16.1)和4.85(2.0～12.1)。

此外，与体检健康者(携带4G基因率为76.79%)相比，剖腹产患者(85.04%)，烧伤患者(83.42%)，心脑血管疾病患者(86.36%)差异均有统计学意义(χ2值分别为8.180、6.175、6.009，P<0.05)。

2.3手术后烧伤患者深静脉血栓事件率 追踪200例烧伤手术患者术后2个月内深静脉血栓事件发生情况，结果发现其中139例患者在患病后2个月内发生了深静脉血栓事件。PAI-1(4G/5G) 4G4G基因型患者74例，发生深静脉血栓64例(86.49%)，PAI-1(4G/5G) 4G5G基因型患者80例，发生深静脉血栓52例(65.00%)，PAI-1(4G/5G) 5G5G基因型患者46例，发生深静脉血栓23例(50.00%)，不同基因型患者间的差异有统计学意义(χ2=21.651，P<0.01)。

3 讨论

本研究发现PAI-1(4G/5G)基因4G型携带者在体检健康者和手术患者间的分布频率存在差异。体检健康者携带4G基因率为76.79%，剖腹产患者携带4G基因率为85.04%，烧伤患者携带4G基因率为83.42%，心脑血管疾病患者携带4G基因率为86.36%。有文献报道，PAI-1(4G/5G)基因4G/4G 基因型在病例组中的分布频率为60.0%，在正常对照组中为50.0%；4G等位基因在病例组中的分布频率为70.9%，在正常对照组中为60.8%[4]。亦有文献表明，PAI-1(4G/5G)基因4G/4G型、4G/5G型、5G/5G型在静脉血栓栓塞症(VTE)组的分布频率分别为42.50%、35.00%、22.50%,在对照组分布频率分别为17.50%、43.12%、39.38%[5]。本研究数据和上述文献报道的结果基本一致，PAI-14G基因型在疾病组较健康人群明显升高,证实4G基因型与静脉血栓栓塞发病具有一定的相关性,可作为独立的危险因素[5]。手术患者本身因手术而可能发生血栓，且各疾病组患者携带4G基因型的比率又明显高于体检健康组，故而进一步增加了手术患者术后发生深静脉血栓风险。

本研究追踪了200例烧伤手术患者，在患者术后2个月内定期通过髂总静脉或下腔静脉行深静脉超声评估，通过探头加压管腔是否有明显变化或者不能完全闭合消失评估深静脉血栓事件是否发生。结果发现200例患者中有139例患者在患病后2个月内发生了深静脉血栓事件。4G4G基因型发生血栓事件比例为86.49%，4G5G基因型发生血栓事件比例为65.00%，5G5G基因型发生血栓事件比例为50.00%，不同基因型患者间深静脉血栓发生率差异有统计学意义。对于同样接受手术治疗的患者来说，纯合突变型(4G4G)发生深静脉血栓事件的风险是最高的，其次是杂合突变型(4G5G)。然而，本研究对于手术患者术后情况跟踪的病例数偏少，仅限于烧伤科且能行深静脉超声的术后患者，后期我们将逐步追踪并分析不同基因型各种手术患者术后深静脉血栓事件的发生风险。

对于携带PAI-1(4G/5G)4G基因型的健康人群来说，需关注如下肢发生疼痛，上臂、胸壁皮下静脉扩张，非凹陷性水肿等；定期检测凝血指标等如D-二聚体状态，静脉造影，下肢血管多普勒超声等；给予低脂、高蛋白、高维生素、易消化的饮食，有心力衰竭者应给予低盐饮食；调整生活状态，戒烟限酒等降低风险。对于携带4G基因型的患者来说，发生静脉血栓可采用药物预防如肝素、低分子肝素，Ⅹa因子抑制剂如利伐沙班、阿替沙班、磺达肝素钠，维生素K拮抗剂如华法林；应防止深度静脉血栓及肺栓塞发生。综上所述，本研究发现通过筛查PAI-1(4G/5G)基因可以为携带PAI-1(4G/5G)4G基因型的手术患者在预防静脉血栓、脑卒中等血液高凝状态风险的发生提供精准的数据支持。