黑曲霉素J4对中低品位磷矿粉的溶磷效果及重金属释放的影响

刘娟 ，张乃明 *，何云

1.云南农业大学植物保护学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学资源与环境学院，云南 昆明 650201；3.云南省土壤培肥与污染修复工程实验室，云南 昆明 650201

磷是作物必需的重要营养元素（钟传青等，2005；刘文干等，2012；穆淑红，2015），而土壤中绝大多数磷难以被植物吸收利用，需要向土壤中施入可溶性的磷肥来提高作物的产量，但由于其迅速转化为铁、铝、钙等多种难溶性磷酸盐，磷肥的利用效率一般都低于 25%（乔志伟等，2013；赵小蓉等，2002；杨顺等，2018；张峰等，2019），磷肥利用率低不仅使磷素在土壤中富集（王光华等，2005），同时加剧了磷肥生产对磷矿粉的需求。中国磷矿资源虽然丰富（钟传青等，2004；王舒，2016），但中低品味磷矿占到了80%以上，这些磷矿难以分选和加工，难以生产成高浓度磷肥或复肥（林启美等，2002；杨威杉等，2018）。同时，磷矿资源属于非再生性自然资源（谌书等，2007），随着可利用富矿以及具有开发价值的磷矿不断减少，对磷矿的需求和磷矿资源短缺的矛盾日益突出。

传统的磷肥生产方法不仅依赖于较高品位的磷精矿和大量的硫酸、硝酸和盐酸等工业原料，并且在选矿和加工过程中需要巨大的设备投资和较高的生产费用，由此带来的环境污染也会对我们磷肥工业的发展造成巨大威胁（肖春桥，2009）。基于节约资源、降低成本以及日渐严重的环境问题，许多研究者都在积极寻求充分合理利用中低品位磷矿资源的新途径。目前已有研究表明，利用溶磷微生物将是活化磷矿粉中难溶性磷的一个有效途径（王同等，2014）。溶磷微生物对磷矿粉的溶磷作用主要是通过溶磷微生物在其生长代谢过程中产生有机酸类物质而表现出来（易艳梅等，2012；范丙全等，2002），其机制主要是通过有机酸对铁、铝、钙等金属离子的络合而导致磷的溶出，因此，溶磷微生物在溶解磷矿粉的同时，也会引起伴生性重金属离子的释放（汤帆，2015）。过去人们的研究主要集中在高效溶磷菌的筛选、溶磷微生物的溶磷效果及机理、溶磷菌对磷矿粉的最佳溶解工艺等方面，但是在磷矿粉微生物活化过程中出现的伴生性重金属问题没有引起足够的重视。为了将难分选的中低品味的磷矿资源利用起来，提高中低品味磷矿粉的利用效率，同时还应减少磷矿原石所带来的化学磷肥伴生性重金属问题（林启美等，2002），本研究使用从土壤中分离出来的溶磷菌——黑曲霉J4（Aspergillus NigerJ4），分析其在不同培养基发酵中对磷矿粉的溶解能力以及磷矿粉伴生重金属元素释放的影响，探索利用微生物活化磷矿粉，这对于高效利用中国现有中低品位的磷矿资源具有重要战略意义。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

供试菌株是本实验室从严重缺磷土壤中分离获得的溶磷菌——黑曲霉J4（Aspergillus NigerJ4）。

1.1.2 磷矿粉来源

磷矿粉采自云南省安宁市云龙山，在开采现场采集磷矿石样品 4个，分别为 YL-1A，YL-2A，YL-3A，YL-4A，磷矿样品均为矿区下层磷块岩，属白云质沙砾屑磷块岩风化矿，采集后均通过 100网目，供试磷矿粉的基本化学组成见表1。

表1 供试磷矿粉的化学成分Table1 Element composition of the phosphate rock ω/%

1.1.3 培养基

A培养基：木薯粉液化液（总糖含量14%左右），硝酸铵2.5 g，磷酸二氢钾2.5 g，七水硫酸镁0.25 g，硫酸铜 0.00006 g，硫酸锌 0.00025 g，硫酸亚铁0.0013 g，硫酸锰0.001 g，水1000 mL。

B培养基：木薯粉液化液（总糖含量14%左右），硝酸铵5 g，水1000 mL。

C培养基（察氏培养基）：木薯粉液化液（总糖含量14%左右），硝酸钠2 g，七水硫酸镁0.5 g，氯化钾0.5 g，七十四水硫酸亚铁0.01 g，磷酸氢二钾1 g，水1000 mL。

1.1.4 培养条件

A，B，C培养基：培养基摇瓶发酵培养基按完全培养基，在250 mL三角瓶中装液100 mL，灭菌后接种 1 mL黑曲霉 J4菌液于恒温摇床（180 r∙min-1，35 ℃）分别发酵培养 30、48、60 h 后，添加各磷矿粉各10 g，发酵培养7 d，离心过滤测定相关指标。以上处理设置3个重复。

1.2 测定项目及方法

pH值采用PHS-3C精密酸度计进行测定；磷矿粉各化学成分参照 GB1870—1881-95测定；有效磷：发酵溶磷完成后，发酵液离心过滤，通过钼蓝比色法测定滤液中有效磷含量。磷矿粉中伴生性重金属测定：称取磷矿粉1 g，置于150 mL三角瓶中，加王水和高氯酸消煮完全，过滤到100 mL容量瓶中定容后用原子吸收法测定伴生性重金属含量；滤液中伴生性重金属测定：发酵溶磷完成后，发酵液离心过滤，取滤液5 mL置于150 mL三角瓶中，加王水和高氯酸消煮完全，过滤到100 mL容量瓶中定容后用原子吸收法测定滤液中伴生性重金属含量；溶磷率=培养基中发酵溶磷量/磷矿粉中总磷量；伴生性重金属溶出率=培养基中发酵伴生性重金属溶出量/磷矿粉中总伴生性重金属含量。

1.3 数据处理

试验数据采用 Excel 2007软件进行整理和作图，采用SPSS 18.0软件进行方差分析和显著性检验，检验方法采用ANOVA法，显著水平为0.05。

2 结果与分析

2.1 黑曲霉J4在不同培养基发酵中对磷矿粉的溶磷效果

黑曲霉 J4在不同培养基发酵中对磷矿粉的溶磷效果如表2所示，由表可知，在不同培养基中，黑曲霉 J4菌株均能不同程度地促进磷矿粉中磷的溶出。在不同培养基 A、B、C中的溶磷量分别为8.05—13.32、6.50—10.90、14.07—17.23 g∙kg-1，溶磷率分别为 34.84%—52.26%，26.11%—42.77%和57.42%—68.31%。在 A培养基中，各磷矿粉在 A培养基发酵中的溶磷量的平均值为10.20 g∙kg-1，平均溶磷率为 43.18%，各磷矿粉中，YL-3A磷矿粉的溶磷量最高，为13.32 g∙kg-1，而YL-2A磷矿粉的溶磷量最低，为8.05 g∙kg-1，最大溶磷量是最小溶磷量的1.65倍。在B培养基中，各磷矿粉在B培养基发酵中的溶磷量的平均值为8.72 g∙kg-1，平均溶磷率为37.16%，YL-3A磷矿粉的溶磷量最高，其次为YL-2A和YL-1A，YL-4A磷矿粉的溶磷量最低，各磷矿粉之间溶磷量达到了显著水平。在C培养基发酵中的溶磷量的平均值为15.65 g∙kg-1，平均溶磷率为63.65%，YL-1A磷矿粉的溶磷量最高，为 17.23 g∙kg-1，YL-2A磷矿粉的溶磷量最低，为14.07 g∙kg-1，最大溶磷量是最小溶磷量的1.22倍。不同培养基中黑曲霉 J4菌株对磷矿粉的溶磷能力差异明显，在不同培养基发酵中对磷矿粉的溶磷率主要表现为C培养基＞A培养基＞B培养基。

表2 黑曲霉J4在不同培养基发酵中对磷矿粉的溶磷效果Table 2 Effect of Aspergillus Niger J4 on dissolving phosphorus in phosphate rock powder by fermentation in different media

2.2 黑曲霉J4在不同培养基发酵中对磷矿粉中伴生性重金属元素溶出的影响

2.2.1 黑曲霉 J4在不同培养基发酵中对磷矿粉中伴生性Pb溶出的影响

黑曲霉J4不仅可以促进磷矿粉中磷的溶出，还会引起磷矿粉中伴生性重金属元素的释放。黑曲霉J4在不同培养基中对磷矿粉中伴生性Pb溶出的影响如图1所示，由图1可知，不同培养基中，黑曲霉 J4会不同程度地引起磷矿粉中伴生性 Pb的溶出。A、B、C培养基中伴生Pb含量分别为1.37—2.33、1.76—2.66、1.21—2.08 mg∙kg-1，不同培养基中伴生Pb溶出率分别为7.59%—21.11%、9.02%—19.12%和8.15%—12.79%。3种培养基发酵磷矿粉中伴生性Pb溶出量和溶出率都表现为C培养基＜A培养基＜B培养基。在A培养基中，YL-3A磷矿粉Pb的溶出量显著高于其他3个磷矿粉Pb的溶出量，达到2.33 mg∙kg-1，伴生Pb溶出率高达 21.11%，YL-2A磷矿粉Pb的溶出量最低，为1.37 mg∙kg-1，而伴生Pb溶出率为8.44%，YL-2A磷矿粉与YL-1A差异不显著。在B培养基中，YL-1A磷矿粉Pb的溶出量显著低于其他3个磷矿粉Pb的溶出量，为1.76 mg∙kg-1，磷矿粉Pb溶出率为9.02%，其他 3个磷矿粉Pb的溶出量差异性不显著。在C培养基中，各磷矿粉在培养基C中Pb的溶出量的平均值为1.71 mg∙kg-1，Pb的平均溶出率为10.57%。在这些磷矿粉中，YL-2A磷矿粉中的Pb的溶出量最大，其次是KY-4A，KY-1A，而KY-3A中Pb的溶出量最小。

图1 黑曲霉J4在不同培养基发酵磷矿粉中伴生性Pb溶出量及溶出率Fig.1 The amount and rate of Pb release from phosphate rock fermented by Aspergillus niger J4 in different medium

2.2.2 黑曲霉 J4在不同培养基中对磷矿粉中伴生性Cd溶出的影响

黑曲霉 J4在不同培养基中对磷矿粉中伴生性Cd溶出的影响如图2所示，由图2可知，不同培养基中，黑曲霉J4会引起磷矿粉中伴生性Cd的释放。A、B、C培养基中伴生Cd含量分别为0.38—1.79、0.88—1.46、0.35—0.63 mg∙kg-1，不同培养基中伴生 Cd溶出率分别为 8.55%—32.77%、8.13%—32.92%、3.89%—10.93%。不同培养基发酵各磷矿粉伴生 Cd含量的平均值为1.11、1.02、0.47 mg∙kg-1，3种培养基发酵磷矿粉中伴生性Cd溶出量的大小为A培养基＞B培养基＞C培养基，从各磷矿粉中伴生性重金属的溶出率来看，不同培养基发酵各磷矿粉伴生 Cd溶出率的平均值为 18.01%、18.79%和 8.18%，平均 Cd溶出率的大小为 B培养基＞A培养基＞C培养基。在A培养基中，YL-2A磷矿粉中Cd的溶出量和溶出率最大，分别为1.79 mg∙kg-1和32.77%。YL-1A磷矿粉中Cd的溶出量和溶出率最小，0.38 mg∙kg-1和8.55%。在B培养基中，YL-1A磷矿粉中Cd的溶出量和溶出率最大，其次是YL-4A和YL-2A，而YL-3A磷矿粉中Cd的溶出量和溶出率最小，且各磷矿粉中Cd的溶出量和溶出率的差异显著。在 C培养基中，各磷矿粉中Cd的溶出量和溶出率均偏低，4个磷矿粉伴生Cd的溶出量分别为 0.37、0.52、0.35、0.63 mg∙kg-1，Cd溶出率分别为8.31%、9.59%、3.89%和10.93%，在4个磷矿粉中，YL-4A磷矿粉中Cd的溶出量和溶出率最大，YL-3A磷矿粉中Cd的溶出量和溶出率最小。

2.2.3 黑曲霉 J4在不同培养基中对磷矿粉中伴生性As溶出的影响

黑曲霉 J4在不同培养基中对磷矿粉中伴生性As溶出的影响如图3所示，由图3可知，不同培养基中，黑曲霉J4会引起磷矿粉中伴生性As的释放。A、B、C培养基中伴生As含量分别为0.10—0.60、0.15—0.92、0.11—0.30 mg∙kg-1，不同培养基中伴生As溶出率分别为1.10%—3.24%、1.65%—4.96%、1.10%—2.40%。在A和B培养基中，YL-3A磷矿粉中的As的溶出量最大，A、B培养基中磷矿粉中的 As的溶出量分别为 0.60 mg∙kg-1和 0.92 mg∙kg-1，其溶出率分别为3.24%和4.96%。YL-1A磷矿粉中的 As的溶出量最小，A、B培养基中磷矿粉中的As的溶出量分别为 0.10 mg∙kg-1和 0.15 mg∙kg-1，其溶出率分别为1.1%和1.65%。在C培养基中，各磷矿粉中 As的溶出量和溶出率均偏低，各磷矿粉伴生 As的溶出量分别为 0.11、0.30、0.20、0.24 mg∙kg-1，As的溶出率分别为1.21%、2.23%、1.10%和 2.40%，在各个磷矿粉中，YL-2A磷矿粉中 As的溶出量和溶出率最大，YL-1A磷矿粉中As的溶出量和溶出率最小。不同培养基对磷矿粉中伴生性As溶出量和溶出率的大小为B培养基＞A培养基＞C培养基。

2.3 黑曲霉J4在对不同培养基发酵中磷矿粉的溶磷率与伴生重金属的相关性

图2 黑曲霉J4在不同培养基发酵磷矿粉中伴生性Cd溶出量及溶出率Fig.2 The amount and rate of CD release from phosphate rock fermented by Aspergillus niger J4 in different medium

图3 黑曲霉J4在不同培养基发酵磷矿粉中伴生性As溶出量及溶出率Fig.3 The amount and rate of As release from phosphate rock fermented by Aspergillus niger J4 in different medium

为进一步了解黑曲霉 J4在对不同培养基发酵中磷矿粉的溶磷率与伴生重金属的关系，我们将不同培养基中磷矿粉的溶磷率与磷矿粉中易随磷溶出的伴生重金属（Pb、Cd和As）的溶出率进行了分析，研究发现不同培养基发酵溶磷率磷矿粉中伴生性重金属溶出率之间存在一定的相关性，但其相关程度与培养基种类以及磷矿粉中伴生性重金属种类而存在差异。在A培养基中，黑曲霉J4对磷矿粉的溶磷率与各磷矿粉的溶磷量和磷矿粉中伴生性Pb溶出率呈极显著正相关，与伴生性As溶出率呈显著性正相关，与伴生性Cd溶出率呈负相关，但相关性不显著。在B培养基中，黑曲霉J4对磷矿粉的溶磷率与各磷矿粉的溶磷量和磷矿粉中伴生性Pb溶出率呈正相关，与伴生性Cd和As溶出率呈负相关，但相关性不显著。在C培养基中，黑曲霉J4对磷矿粉的溶磷率与各磷矿粉的溶磷量之间呈极显著正相关，与伴生性 Pb、Cd和As溶出率呈负相关，其中，与 As溶出率达到了显著性（表3）。

3 讨论

3.1 黑曲霉J4在不同培养基发酵对磷矿粉的溶磷效果的影响

溶磷菌广泛存在于自然界中，黑曲霉是一种常见的溶磷菌，黑曲霉有高效溶磷作用（冯宏等，2010），在李露莉等（2010）的研究中，当磷矿粉用量为5 g∙L-1时，黑曲霉溶磷率达20.87%。刘晓芳等（2005）通过发酵培养试验发现，黑曲霉对难溶性的 Ca3(PO4)2、CaHPO4、FePO4、ALPO4有良好的溶解作用，部分溶解率高达70%以上。Agnihotri（1979）研究发现，当培养温度为30 ℃，黑曲霉在培养基中培养20 d，能使磷矿粉中的磷溶出87.7%。Narsion et al.（2000）研究也同样发现，将曲霉接种到以不同来源的磷矿粉作为唯一磷源的培养基中，培养14 d，最高有45%的磷释放出来。本研究中发现，黑曲霉素J4在不同培养基中发酵均能促进磷矿粉中磷的溶出，在不同培养基 A、B、C中的溶磷量分别为 8.05—13.32、6.50—10.90、14.07—17.23 g∙kg-1，溶磷率分别为34.84%—52.26%，26.11%—42.77%和57.42%—68.31%，具有较强的溶磷能力，对实现中低品位磷矿粉中磷的生物高效活化效率具有一定的实践意义。

同时，我们在研究中发现，在不同培养基发酵中对磷矿粉的溶磷量和溶磷率均表现为 C培养基＞A培养基＞B培养基，在C培养基中发酵对云龙山地区的YN-1A，YN-2A和YN-3A 3个磷矿粉的溶磷率均达到了60.00%以上。黑曲霉J4在不同培养基发酵对磷矿粉的溶磷效果差异大，可能是由于黑曲霉素 J4在不同培养基中分泌的有机酸的数量不同。黑曲霉J4在培养基中可能分泌酒石酸，苹果酸，乙酸，柠檬酸，草酸和丁二酸等有机酸，这些有机酸能与铁、铝、钙等离子螯合，使磷矿粉中难溶性的磷转化为有效磷，从而提高磷矿粉中磷素的利用率（唐超西等，2012）。此外，磷矿粉中元素种类和含量的不同，其矿物结构和化学键不同，也可能导致黑曲霉J4对磷矿粉的溶磷能力不同（钟传青等，2004；刘文干等，2012）。

表3 黑曲霉J4在对不同培养基发酵中磷矿粉的溶磷率与伴生重金属的相关性Table 3 Correlation between Phosphate rock solubilization rate and associated heavy metals in the fermentation of Aspergillus Niger J4 on different medium

3.2 黑曲霉素J4在活化磷矿粉过程中对磷矿粉中伴生性重金属释放的影响

黑曲霉素J4不仅可以促进磷矿粉中磷的溶出，还会引起磷矿粉中伴生性重金属的释放，在测定的Pb、Cd和As 3种重金属元素中，磷矿粉中伴生性Pb随黑曲霉素J4溶出率的范围为7.59%—21.11%，各磷矿粉在不同培养基中 Pb溶出率的平均值为12.33%，磷矿粉中伴生性Cd随黑曲霉素J4溶出率的范围为3.89%—32.77%，各磷矿粉在不同培养基中Cd溶出率的平均值为14.99%，而磷矿粉中伴生性 As随黑曲霉素 J4溶出率的范围为 1.10%—4.96%，各磷矿粉在不同培养基中As溶出率的平均值为2.39%，由此可见，黑曲霉J4在活化磷矿粉过程中，磷矿粉中伴生性Cd最容易随黑曲霉J4释放，其溶出率最高。而As相对于其他两种重金属而言，其释放最少，其最高溶磷率不超过4.96%。

在前面中分析中我们已经知道，Cd是含量最多也是最容易随黑曲霉J4而释放的伴生性重金属，如果将这些磷肥施用于农田，将加重农田中由磷矿石原料所带来的化学磷肥伴生性重金属问题。通过比较黑曲霉 J4在不同培养基发酵中对磷矿粉中伴生性重金属元素溶出的影响，我们发现，同一伴生性重金属在不同的培养基以及不同的磷矿粉中，其溶出量率存在差异。3种培养基发酵磷矿粉中伴生性Pb和As溶出量和溶出率都表现为C培养基＜A培养基＜B培养基，而Cd溶出量表现为C培养基＜B培养基＜A培养基，平均Cd溶出率C培养基＜A培养基＜B培养基。在C培养基中，Pb、Cd和As 3种重金属元素较稳定，Pb、Cd和As的平均释放率分别为10.57%、8.18%和1.74%，在3种培养基中，其伴生性重金属的溶出率最低。重金属在培养基中溶出的难易程度主要是受伴生性重金属在磷矿粉中所在晶格位点差异的影响。

4 结论

（1）黑曲霉J4在3种培养基中发酵均能促进磷矿粉中磷的溶出。各磷矿粉在不同培养基发酵中的溶磷量为6.50—17.23 g∙kg-1，溶磷率为26.11%—68.31%，黑曲霉J4在培养基发酵中对磷矿粉的溶磷量和溶磷率大小为C培养基＞A培养基＞B培养基。

（2）黑曲霉J4在活化磷矿粉过程中，磷矿粉中伴生性Cd最容易随黑曲霉J4释放，其溶出率最高。而 As相对于其他两种重金属而言，其最高溶磷率不超过4.96%。黑曲霉J4在3种培养基发酵磷矿粉中伴生性Pb和As溶出量和溶出率都表现为C培养基＜A培养基＜B培养基，而Cd溶出量表现为C培养基＜B培养基＜A培养基，平均Cd溶出率C培养基＜A培养基＜B培养基。

（3）黑曲霉J4在对不同培养基发酵中磷矿粉的溶磷率与伴生重金属的关系因培养基和重金属种类而异。在3种培养基中，黑曲霉J4对磷矿粉的溶磷率与各磷矿粉的溶磷量之间呈极显著正相关，在A培养基中，黑曲霉J4对磷矿粉的溶磷率与磷矿粉中伴生性Pb溶出率呈极显著正相关，与伴生性As溶出率呈显著正相关，在C培养基中，黑曲霉J4对磷矿粉的溶磷率与伴生性As溶出率呈显著性负相关，今后应进一步开展不同粒径磷矿粉的溶出研究。