呼吸道合胞病毒下呼吸道感染患儿外周血miR-145表达及与Th1/Th2平衡的关系

麦朗君， 翟佳羽， 林烈桔， 符学兴

(海南省儋州市人民医院儿科， 海南 儋州 571700)

呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus，RSV)广泛流行于世界各地，是导致婴幼儿和儿童严重的毛细支气管炎和肺炎常见病原体，主要表现为反复喘息[1,2]。但关于RSV下呼吸道感染发病机制至今仍不清楚，临床症状与哮喘十分相似，推测其引起炎症反应机制与哮喘相类似。大多数研究证明，辅助性T细胞亚群Th1/Th2的平衡失调导致的Th2型免疫反应是哮喘发病关键[3]。微小RNA(microRNA，miRNA)属于高度保守非编码RNA小分子，可调节细胞各种代谢活动，在疾病中发挥重要作用[4]。miRNA-145位于人类5号染色体长臂3区2带(5q32)，在多种肿瘤中表达均明显下调[5,6]。有研究发现，miR-145可以调节哮喘患者Th1/Th2平衡[7]。但是关于miR-145在RSV下呼吸道感染患儿中表达情况及其与Th1/Th2平衡间关系尚不清楚。因此本研究通过检测RSV下呼吸道感染患儿外周血单个核细胞中miR-145、Th1、Th2亚群百分率等水平，以探究两者间关系。

1 资料与方法

1.1一般资料:选取2018年6月至2019年11月本院儿科建卡就诊的RSV毛细支气管炎和肺炎患儿60例为实验组，男性28例，女性32例，平均年龄(10.07±5.61)个月，毛细支气管炎患儿31例，肺炎患儿29例。纳入标准：①急性发病，病史在一周以内；②鼻咽部脱落细胞经碱性磷酸酶抗碱性磷酸酶桥联酶标法(APAAP法)检测RSV抗原阳性；③无过敏性病史；④年龄≤3岁。排除标准：①病原检测不单一，其他病毒核酸感染；②免疫缺陷；③先天性心脏病；④支气管或肺发育不良；⑤先天性气道畸形；⑥过敏史或家族哮喘史。另选取同期在本院体检健康小儿60例为对照组，男性30例，女性30例，平均年龄(10.35±5.59)个月。两组在性别、年龄上比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经儋州市人民医院伦理委员会批准通过，所有样品采集均取得受试小儿家属知情同意并签字，符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》。

1.2方 法

1.2.1样品采集:患儿住院次日、健康小儿体检当日采集外周静脉血4mL，取出后室温下立即取其中1mL加入无菌肝素抗凝管(20IU/mL)，通过流式细胞术检测Th1/Th2细胞数量；余下3mL加入无菌肝素抗凝管离心(2000r/min，离心5min)，上层取血浆，用于ELISA检测细胞因子白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-5(IL-5)表达水平，密度梯度离心法对外周血中单个核细胞进行分离。将血浆和外周血单个核细胞样品置于-80℃保存，备用。

1.2.2流式细胞术检测Th1细胞百分率、Th2细胞百分率:外周静脉血标本中加红细胞裂解液静置后离心，弃上清，得到PBMCs调PBMCs细胞，分别加入PE、FITC双色免疫荧光双标记单克隆抗体及阴性对照孵育20min，PBS洗涤后，甲醛PBS固定，Attune NxT型流式细胞仪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)检测，计数5000个细胞中的IL-4+、IFN-γ+阳性细胞率。藻红蛋白(PE)标记大鼠抗人IL-4单抗、异硫氢酸荧光素(FITC)标记的大鼠抗人IFN-γ单抗均购自北京义翘神州科技有限公司。

1.2.3荧光定量PCR检测miR-145表达水平:采用RNA提取试剂盒(美国Molecular Research Center公司)提取血浆总RNA，反转录得cDNA。采用CFX96型qRT-PCR仪(美国Bio-Rad公司)对miR-145进行扩增。qRT-PCR反应体系共10μL：miScript SYBR Green Mix 5 μL，cDNA(50 ng/μL)1μL，上下游引物(10 μM)各0.5μL，ddH2O 3.0μL。反应条件：95℃，90s；95℃，30s；63℃，30s；72℃，15s；45个循环。miR-145及内参U6的引物序列见表1。引物由上海生工生物公司设计合成；采用2-△△CT法对血清miR-145表达水平进行定量分析。引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4酶联免疫法测定血浆中细胞因子水平:采用酶联免疫法测定血浆中IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-5水平，检测操作严格按照试剂盒说明书进行(IL-2、IL-4、IL-5 ELISA试剂盒均购自北京义翘神州科技有限公司，INF-γ试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。为控制检测质量，本次研究所有样品的检测均由检验科同一批人员在同台仪器上操作，每个样本均设三次重复。

2 结 果

2.1各组外周血单个核细胞miR-145表达水平比较:实验组miR-145表达水平显著高于对照组(P<0.05)，见表2。

表2 各组外周血单个核细胞miR-145表达水平比较

2.2各组外周血Th1细胞百分率、Th2细胞百分率、Th1/Th2比值比较:实验组外周血Th1细胞百分率、Th1/Th2比值显著低于对照组(P<0.05)，两组外周血Th2细胞百分率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 外周血Th1细胞 Th2细胞百分率比较

2.3各组血浆中细胞因子含量比较:实验组血浆中IL-2、IFN-γ表达水平显著低于对照组，IL-4、IL-5表达水平显著高于对照组(P<0.05)，见表4。

2.4实验组外周血miR-145表达水平、Th1/Th2比值与细胞因子相关性分析:实验组miR-145与IL-2、IFN-γ、Th1/Th2比值呈负相关(P<0.05)，与IL-4、IL-5呈正相关(P<0.05)，见表5。

表4 各组血浆中细胞因子含量比较

表5 miR-145与细胞因子水平相关性分析

3 讨 论

RSV是引起婴幼儿和老年人下呼吸道感染如支气管炎和肺炎的常见病原体，导致患者住院甚至死亡。miRNA在多种肿瘤中作用已被研究者了解，有研究表明miRNA在免疫调控中同样扮演十分重要角色，当其功能异常可导致多种免疫疾病发生[8]。目前针对miR-145研究多偏向肿瘤领域，而在免疫调控等研究较少[9]。近年研究发现miR-145与免疫调控关系密切，Li等[10]研究证实老年人血清中miR-145表达上调，影响老年人免疫功能调控。本研究发现，实验组miR-145表达水平明显高于对照组，说明miR-145可能与RSV下呼吸道感染有关。Fedele等[11]研究发现RSV诱导感染引发的哮喘与Th2反应增高有关。本研究发现与对照组比较，实验组外周血Th1细胞百分率、Th1/Th2比值显著下降，提示与患者相关的免疫功能变化以外周血Th1/Th2比值下降为主要表现。

原始辅助性T细胞根据分泌细胞因子种类不同分为Th1细胞、Th2细胞。TNF-α、IFN-γ、IL-2等细胞因子由Th1细胞分泌产生；IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等细胞因子由Th2细胞分泌产生。李丽华等[12]研究发现，经过雾化吸入干扰素α2b注射液治疗的RSV肺炎儿童病情明显减轻，肺泡灌洗液中IL-2含量上升，证明IL-2可能发挥抗病毒作用，减轻肺部炎症和损伤。彭智等[13]研究表明，IL-4含量增加可能与RSV感染有关。黄燕等[14]研究发现RSV感染的幼龄大鼠血清中IFN-γ含量显著降低，说明IFN-γ在RSV下呼吸道感染中起重要作用。Mosquera等[15]国外研究表明，经过阿奇霉素预防RSV感染的小鼠支气管肺泡中IL-5含量显著降低，可见IL-5在RSV诱导的下呼吸道感染中具有一定作用，与呼吸道炎症有关。本研究显示与对照组相比，实验组血浆中IL-2、IFN-γ含量显著降低，IL-4、IL-5含量显著升高，与之前研究相似，提示RSV下呼吸道感染患儿体内Th1相关炎症因子水平降低，Th2相关炎症因子水平升高。另外，实验组miR-145与IL-2、IFN-γ呈负相关，与IL-4、IL-5呈正相关，提示miR-145可能通过影响机体中Th1、Th2相关炎症因子水平，参与RSV下呼吸道感染。进一步研究发现，RSV下呼吸道感染患儿外周血miR-145表达水平与Th1/Th2比值呈负相关，提示miR-145可能通过对辅助性T淋巴细胞Th1和Th2亚群的比例进行调控，影响血浆中IL-2、IL-4、IFN-γ细胞炎症因子的分泌，参与RSV下呼吸道感染过程。

综上所述，RSV下呼吸道感染患儿外周血miR-145表达上调，与Th1/Th2比例呈负相关，可能通过调控IL-2、IL-4、IFN-γ、IL-5等细胞因子表达，影响RSV下呼吸道感染发生。本研究不足之处在于样本量过少，需扩大样本量对RSV下呼吸道感染患儿外周血miR-145表达及与Th1/Th2平衡的关系进步一深入研究。