夹脊电针对兔退变腰椎间盘组织中caspase3、caspase9表达的影响

汪伯毅，邹璟，黄国付

以椎间盘退变为始动因素的腰椎退行性疾病临床多发，且易复发。退变基础上，若伴随有脊柱持续轴向负荷，易加速椎间盘老化、纤维环破裂，继而出现影像学改变以及腰腿部不适症状。既往临床医生多关注腰椎间盘退行性疾病的症状处理，对于椎间盘退变机制的重视不够，一定程度上影响了椎间盘退行性疾病的有效防治。一直以来，以针灸为主的中医外治手段广泛应用于腰椎退行性疾病的治疗中，但针灸治疗的机理尚不十分明确。近年来，研究者注意到细胞凋亡异常在椎间盘退变中作用关键[1]，细胞凋亡增加后椎间盘退变的发生和发展明显加强[2]，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族在细胞凋亡过程中具有核心调控作用。能否探寻干预椎间盘细胞凋亡的手段值得广大科研工作者研究。本研究拟观察夹脊电针对兔退变腰椎间盘组织中caspase-3、caspase-9表达的影响，试图从细胞凋亡角度探讨电针防治腰椎退行性疾病的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物与器材与试剂 ①动物：本次实验20只骨骼发育成熟的雄性新西兰大白兔(月龄5～6个月，体质量3.0～4.0kg)均由武汉大学实验动物中心提供(合格证书编号42000500005577)。开始实验前大白兔均给与适应性饲养1周(武汉市第一医院中心实验室)。将20只实验兔进行随机编号后分为正常组、假模型组、模型组和电针组4个组别。每组各5只。②器材：东风汽车设备制造厂提供椎间盘轴向加压造模器；实验兔固定器为课题组成员自己制备；采用美国通用电气公司生产的Signa HDx 3.0T磁共振器；采用南京济生医疗科技有限公司生产的韩氏穴位神经刺激仪；针灸针为一次性，由苏州医疗用品厂有限公司提供，规格0.30mm×25mm；切片机由上海徕卡仪器有限公司生产提供(RM2016)；采用上海福玛实验设备有限公司提供的DGX-9003B型烘箱；采用格兰仕微波炉电器有限公司提供的P70D20P-TF型微波炉；采用北京六一仪器厂生产的WD-9405A型脱色摇床；采用重庆光电仪器有限公司提供的XSP-C204型普通光学显微镜；③试剂：PBS溶液(0.01M)；NaH2PO4(0.593g)；Na2HPO4(5.802g)；NaCl(17.0g)；去离子水(ddH2O，定容至2L)；10×EDTA修复液(谷歌生物，目录号：G1010H2O2)；H2O2(国药集团化学试剂有限公司，目录号：1001218)；BSA(Roche，北京索莱宝科技有限公司分装，目录号：A8020)；抗兔/鼠通用型免疫组化试剂盒(Dako Denmark A/S，REALTMEnVision+/HRP RABBIT/MOUSE，货号：K5007)；Anti-Caspase-3 Rabbit pAb(GB11009-1)；Anti-Caspase-9 Rabbit pAb(GB11053-1)。

1.2 方法 ①实验造模：参照研究者Kroeber[3]及黄国付等[4]的造模方法，先将实验兔固定于多功能操作台上，用10%水合氯醛(1mL/kg)在兔耳缘静脉注射麻醉。麻醉成功后进行备皮，分别在实验兔L4、L5椎体椎旁约1.5cm定位，稍后做1cm垂直切口，逐层分离肌肉直至椎体暴露，用克氏针(直径1.5mm)垂直刺入两椎体间，借助电钻力辅助克氏针横穿透椎体及对侧皮肤，稍后对切口进行缝合。调整克氏针两端使之平行，最后将自制轴向加压造模器安装于克氏针两端，调整造模器为200N的压力，加压操作时间为28d(见图1A～B)。术后给予实验兔肌肉注射青霉素(4×106U，1次/d，连续5d)预防伤口感染。造模第28d拆除克氏针上的轴向加压造模器，拔出克氏针，将实验兔置于3.0T磁共振器上以评估造模成功与否。造模不成功的实验动物予以剔除后补齐样本量。②实验方法:正常组(n=5)给予自然喂养，不予特殊处理；假模型组(n=5)实验兔在L4、L5椎体间穿入克氏针，不予椎体间加压，不做治疗；模型组(n=5)在L4、L5椎体间穿入克氏针，然后施以轴向加压造模器加压，不做治疗；电针组(n=5)在成功造模的第1d开始施以电针治疗(见图2)。治疗方法：取下加压造模器及克氏针，将实验兔固定于多功能操作台，参照《实验针灸学》[5]中“实验动物穴位标准定位”，用28号1寸长针灸针捻转刺入兔L4-L5双侧夹脊穴(深度0.5～0.8cm)，待针下有沉涩感时连接韩氏穴位神经刺激仪(调频波2/15Hz，强度1～2mA)，每天行1次针刺治疗(时间20min)，治疗周期(连续6d为1疗程，疗程间隔1d，共治疗4个疗程)。

图1A～B 造模

图2 电针治疗

1.3 检测指标 在造模后第28天各组5只实验兔均行L4-5椎间盘MRI平扫，评估造模效果。我们将各实验兔腰椎间盘DWI原始数据传输到处理工作站，应用软件对原始数据进行处理，生成ADC伪彩图。在ADC图上，选取腰椎的中间层面，于L4-5椎间盘中间即在T2WI上观察到的椎间盘髓核矢状位的中央区选择1个点ROI，并测量ADC值，每点重复测量3次，取平均值。MRI分级方案参照Thompson椎间盘退变病理分级：Ⅰ级，NP呈胶冻状，AF排列整齐，透明软骨样CEP厚度均匀，椎体边缘规则。Ⅱ级，NP边缘出现白色纤维组织，AF纤维层之间出现粘蛋白样物质，CEP厚度不规则，椎体边缘有凸出。Ⅲ级，NP内出现固化纤维组织，AF与NP界限不清，AF内粘蛋白样物质广泛沉积，CEP可见灶状缺损，椎体边缘散在骨赘。Ⅳ级，NP内出现平行于CEP的水平裂隙，AF出现放射状或环状破裂，CEP的软骨下出现灶状硬化，椎体骨赘<2mm。Ⅴ级，裂隙贯穿AF和NP，CEP广泛硬化，椎体骨赘>2mm。Ⅰ～Ⅴ级对应计1～5分统计。磁共振扫描之后处死实验兔，取出椎间盘组织，并通过免疫组织化学检测其中caspase-3、caspase-9表达的情况。将石蜡切片置于烘箱(65℃)中烘片2h，脱蜡至水，用PBS进行冲洗(时间5min，共冲洗3次)；将切片置于EDTA缓冲液中，通过微波进行修复，方式为中火至沸后断电，间隔10min后再采用低火至沸的方式；自然冷却后用PBS洗3次，每次洗的时间为5min；切片需阻断内源性过氧化物酶(放入3%过氧化氢溶液，室温下孵育10min)；PBS洗3次，每次5min，甩干后5% BSA封闭20min(封闭电荷)；把BSA液去除，每张切片加入一抗(50μl稀释过)覆盖组织，在4℃环境中过夜；PBS洗3次，每次5min；去除PBS液，每张切片加相应种属的二抗50～100μl，在4℃环境中孵育50min；PBS洗3次，每次5min；去除PBS液，之后每张切片加新鲜DAB溶液50～100μl，通过显微镜来控制其显色；显色完全后，通过蒸馏水或自来水进行冲洗，苏木素复染，1%盐酸酒精分化(1s)，自来水冲洗，氨水返蓝，流水冲洗；切片经过70%～100%梯度的酒精脱水干燥，二甲苯透明，中性树胶封固，其中每10min一个梯度。将切片放在普通显微镜下，调整好位置后观察、采集图片，每张切片选择3个高倍镜视野，镜下棕色为阳性细胞，应用Image J图像分析系统计数阳性细胞后再进行统计学分析。

2 结果

2.1 实验动物造模情况 部分实验兔在建立模型一周内出现一侧耳廓部分缺失，考虑耳源静脉注射损伤所致。造模后共10只实验兔出现下肢活动欠灵活，4只实验兔出现肢体瘫痪，3只实验兔在造模后一周内死亡，肢体瘫痪及死亡的动物均予以剔除后补齐样本量。各组实验兔在造模及电针干预期间食欲正常，反应灵活，无肌肉萎缩，无蓬乱及感染。

2.2 4组实验兔第28天椎间盘MRI比较 正常组实验兔、假模型组实验兔各椎间盘信号强度相当，均为均匀明亮的高信号；而模型组实验兔和电针组实验兔经过造模处理后椎间盘信号强度较相邻正常椎间盘信号有所降低，有的椎间盘甚至出现黑色，表明造模成功。见图3A～H。

图3A～H 4组椎间盘MRI比较

2.3 4组实验兔ADC值及MRI分级比较 与正常组同期比较，假模型组第28天 ADC值及MRI分级差异无统计学意义，模型组第28天 ADC值明显下降(P<0.05)，MRI分级明显上升(P<0.05)；与模型组同期比较，电针组第28天 ADC值明显上升(P<0.05)，MRI分级明显下降(P<0.05)。见表1。

表1 4组实验兔干预第28天ADC值及MRI分级比较

2.4 4组caspase-3及caspase-9表达比较 与正常组同期比较，假模型组第28天 caspase-3及caspase-9表达差异无统计学意义；模型组第28天 caspase-3及caspase-9表达增强(P<0.05)。与模型组同期比较，电针组第28天 caspase-3及caspase-9表达下降(P<0.05)。见图4A～C。

3 讨论

正常椎间盘没有血管组织供应其营养，主要依靠软骨终板途径进行营养供应。随着年龄增长，椎间盘退变程度有所增加，髓核细胞数目会相应减少，含水量下降，合成细胞外基质的质量降低[6]。此时，若长期过度压力施加于椎间盘，会加速软骨终板的损伤，影响到椎间盘的营养物质供应及代谢废物的排除，进一步加剧椎间盘退变,继而引发腰椎间盘突出症，退行性腰椎病。近年来，越来越多的学者[7-8]注意到细胞凋亡与腰椎间盘退变密切相关，随着细胞凋亡增加，椎间盘内细胞数量减少，细胞外基质的生成减少，椎间盘基质原本生成与破坏的动态平衡受到冲击，加速了椎间盘退变。目前研究[9]发现细胞凋亡受到多种信号通路调控，Caspase家族作为细胞凋亡通路中最重要的调控因子，在哺乳动物细胞凋亡启动及执行阶段起重要作用。Caspase-3是caspase级联反应中最重要的凋亡执行因子，而caspase-9作为caspase-3的上游调控因子，与caspase-3共同在细胞凋亡中起到关键作用[10]。研究者赵英伦等[11]报道了腰椎间盘退行性病变患者血清caspase-3，caspase-9浓度明显高于正常健康者，并且血清caspase-3，caspase-9浓度越高者腰椎间盘突出节段越多，进一步说明了凋亡因子caspase-3，caspase-9很可能跟腰椎间盘退变密切相关。而研究者Chen[12]注意到基因敲除动物模型中，抑制caspase-3的表达的实验手段可显著阻滞体内和体外的细胞凋亡。基于此，探寻可以有效减少椎间盘组织中caspase-3，caspase-9表达的手段，将为抑制椎间盘细胞凋亡，继而延缓椎间盘退变提供可能。

目前临床上针对腰椎间盘退行性疾病的干预手段较多，而诸多开放/微创手术，理疗，药物治疗均不能从根本上阻止LDD的发生和发展。电针以其突出的疗效一直活跃于LDD的防治中，且得到了国际社会的关注和认可[13-14]。夹脊穴位于背腰部，脊柱正中旁开0.5寸，与旁行的足太阳膀胱经和正中的督脉联系密切，可通过调控两经而治疗腰痛。而现代研究[15]亦从解剖及神经体液调节角度证实了夹脊穴深刺缓解局部肌肉痉挛，平衡脊椎内外环境而治疗腰痛。

本课题组前期的研究证实了电针对腰椎间盘退变性疾病有良好的治疗作用，且能降低LDD引起的免疫反应[16-17]。本研究通过持续加压装置作用于实验兔腰椎间盘，诱导模型兔发生椎间盘退变(符合人的自然退变征像)，继而通过夹脊电针治疗28d，观察夹脊电针对兔退变椎间盘组织中caspase-3、caspase-9表达的影响，研究结果发现，造模成功后兔腰椎间盘组织中caspase-3、caspase-9表达较造模前明显增强，表明椎间盘退变后，细胞凋亡增加，细胞外基质的生成减少，而电针夹脊穴干预28d后兔退变腰椎间盘组织中caspase-3、caspase-9表达明显降低，表明电针夹脊穴干预有利于细胞凋亡因子表达下调。由此，我们推测夹脊电针通过下调凋亡促进因子caspase-3、caspase-9的表达来抑制椎间盘细胞凋亡，继而纠正细胞外基质合成与分解的失衡，从而来达到延缓椎间盘退变的目的。这将为临床应用针刺防治腰椎退行性疾病提供科学的理论依据。但夹脊电针具体通过哪个信号通路介导而抑制细胞凋亡有待我们进一步研究。