荔枝核总黄酮对两种肝纤维化大鼠模型的作用比较*

成秋宸，覃雯，卓朗，赵永忠，范丽雯，林文斯，刘瑞彪

(1.广西药用植物园西南濒危药材资源开发国家工程实验室，南宁 530023；2.广西医科大学第一附属医院感染性疾病科，南宁 530023；3.桂林医学院第一附属医院消化内科，桂林 541001；4.桂林医学院第一附属医院检验科，桂林 541001)

荔枝核是我国南方的传统中药，具有行气散结、驱寒止痛的功效[1]。荔枝核中的黄酮类化合物总称为荔枝核总黄酮(total flavone ofLitchiChinensisSonn.，TFL)，在抗肝纤维化、抗乙型肝炎病毒、抗氧化等方面均有较好的疗效。本课题组前期研究发现TFL在体外可以抑制肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSCs)的增殖，影响炎症通路中关键性因子核因子-κB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)的表达，一定剂量下的TFL对胆管结扎(bild duct ligation，BDL)肝纤维化大鼠具有较好的退黄、抗纤维化等作用[2-3]。针对逆转肝纤维化的药物开发成为研究的热点和重点。笔者复制了两种常见的肝纤维化大鼠模型，观察TFL对四氯化碳(carbon tetrachloride，CCl4)诱导肝纤维化大鼠和BDL肝纤维化大鼠的治疗作用，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验材料

1.1.1实验动物 SPF级SD大鼠40只，6周龄，雄性，体质量180～220 g，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK桂2009-0002，使用许可证号：SYXK桂2014-0003。入实验室适应1周，相对湿度：50%～70%，温度(25±1) ℃，12 h光照。

1.1.2试剂与仪器 TFL购自南京草本源生物科技有限公司( 含量：83.5%，批号：ZC16081016)。肝功能试剂盒：总胆红素(total bilirubin，T-BiL)、血清碱性磷酸酶(ALP)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)购自美国Abbott公司，委托桂林医学院第一附属医院检验科检测；抗NF-кB单克隆抗体购自CST公司(批号：D14E12)；抗环氧化酶2(cyclo-oxygenase 2，COX-2)单克隆抗体购自CST公司(批号：12282)；抗α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)单克隆抗体购自Abcam公司(批号：32575)；抗GAPDH单克隆抗体(TA-08)购自北京中杉金桥生物公司(批号：141205)；组织切片扫描仪(LEICA SCN400)。

1.2实验方法

1.2.1动物饲养及分组 将大鼠按照随机数字表法分为5组：正常对照组、CCl4模型对照组、BDL模型对照组、CCl4+TFL组、BDL+TFL组，每组8只。CCl4模型对照组和CCl4+TFL组采用40%CCl4+60%玉米油混合液(4 mL·kg-1)灌胃法[4]，每周2次，持续8周。BDL模型对照组和BDL+TFL组采用双重胆管结扎后切断法造模4周。CCl4+TFL组和BDL+TFL组每日1次分别灌胃给予TFL(300 mg·kg-1·d-1)，正常对照组、CCl4模型对照组和BDL模型对照组给予0.9%氯化钠溶液(300 mg·kg-1·d-1)，持续时间均为4周。大鼠每日灌胃前称体质量，并记录。至各组末次灌胃结束后24 h内，放血法处死大鼠。

1.2.2血标本采集及生化指标检测 从大鼠腹主动脉采血，4000 r·min-1离心10 min(r=12.5 cm)，每个指标取血清200 μL，检测T-BiL、ALP、ALT、AST含量。

1.2.3形态学及病理学观察 取肝脏、脾脏测量并称湿质量，计算肝脾指数(肝指数=肝脏湿质量/体质量；脾指数=脾脏湿质量/体质量)。取大鼠肝右叶，4%多聚甲醛溶液固定，石蜡包埋，切片行Sirius red染色，切片扫描，采用Aperio ImageScope12.3版软件计算胶原面积百分比(胶原面积百分比=切片中胶原染色面积/切片中肝脏组织面积×100%)[5]。

1.2.4免疫组织化学法检测α-SMA、CollagenⅠ在肝脏组织中的表达 按照Envision法试剂盒说明书操作，采用0.01 mol·L-1柠檬酸钠(pH值6.0)高温高压修复法，一抗[α-SMA(1：400)、CollagenⅠ(1：400)]孵育2 h，二抗孵育20 min，二氨基联苯胺(diaminobenzidine，DAB)显色，苏木精复染，脱水、透明、封片。阴性对照以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗。α-SMA以细胞质呈现棕黄色为阳性区域，CollagenⅠ以细胞间质呈棕黄色为阳性区域。根据染色面积及染色强度，采用Imag J半定量法进行图像分析。

1.2.5Western blotting 检测α-SMA、NF-κBp65、COX-2蛋白的表达 肝脏组织匀浆，RIPA强碱性裂解液，离心，上清液即为总蛋白，BCA法进行蛋白定量，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrop-horesis，SDS-PAGE)，湿转法转膜，封闭液封闭1 h，一抗(GAPHD、α-SMA、NF-кB p65、COX-2)1：1000比例稀释，4 ℃孵育过夜，室温孵育二抗(1：5000)1 h，洗涤，电化学发光法(electrochemiluminescence，ECL)显影，暗室曝光洗片，以内参GAPDH为标准，Image J测算吸光度(A值)，计算每组蛋白的相对表达量[6]，重复3次求平均值。

2 结果

2.1各组大鼠血清肝功能指标含量 CCl4模型中，TFL给药组ALP、ALT、AST水平均明显下降(P<0.05)；BDL模型中，TFL给药组T-BiL、ALP、ALT水平均明显下降(P<0.05)。表明TFL对CCl4模型和BDL模型大鼠肝功能有较好的改善作用，其中在CCl4模型中TFL以降低ALP、ALT、AST指标为主；在BDL模型中TFL以降低T-BiL、ALP、ALT为主。故TFL在CCl4模型中降低AST指标的作用优于BDL模型，而BDL模型中降低T-BiL方面则优于CCl4模型。见表1。

表1 5组大鼠血清中T-BiL、ALP、ALT、AST含量测定结果Tab.1 Determination results of the serum level of T-BiL，ALP，ALT and AST in five groups of rats

2.2各组大鼠肝纤维化程度及肝脾指数比较 CCl4大鼠模型中肝指数以下降为主，加用TFL后肝指数升高，趋于正常，与正常对照组比较，差异无统计学意义。BDL大鼠模型中，肝脾指数明显增高(F=29.47，66.30，P<0.01)；加用TFL后，肝指数下降，与正常对照组比较，肝指数差异有统计学意义(F=29.47，P<0.01)，脾指数显著下降，与BDL模型对照组比较，差异有统计学意义(F=66.30，P<0.01)。见图1。

根据全切片扫描软件计算染色区域纤维化的面积，两种模型中胶原面积均显著升高，较正常对照组差异有统计学意义(F=22.64，P<0.01)，在两种模型中分别应用TFL，胶原面积均有所下降(F=22.64，P<0.01)，其中CCl4模型大鼠肝脏胶原面积的降低十分显著，与CCl4模型对照组比较差异有统计学意义(F=22.64，P<0.01)。见图1。

A.正常对照组；B.CCl4模型对照组；C.CCl4+TFL组；D.BDL模型对照组；E.BDL+TFL组。①与正常对照组比较，P<0.01；②与BDL模型对照组比较，P<0.01；③与CCl4模型对照比较，P<0.01。图1 5组大鼠肝脾指数及胶原面积比较(n=8)A.normal control group；B.CCl4 model control group；C.CCl4+TFL group；D.BDL model control group ；E.BDL+TFL group.①Compared with normal control group，P<0.01；②Compared with BDL model control group，P<0.01；③Compared with CCl4 model control group，P<0.01.Fig.1 Comparison of liver index，spleen index and the percent of liver collagen area among five groups of rats(n=8)

在CCl4模型中TFL以降低肝纤维化的胶原面积为主；在BDL模型中TFL以降低脾指数和肝纤维化程度为主。故TFL在BDL模型中降低大鼠脾指数的作用优于CCl4模型，而两种模型大鼠肝纤维化的胶原面积都明显降低。

2.3各组大鼠肝组织 α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达(免疫组织化学法检测) 正常对照组α-SMA、CollagenⅠ蛋白微量表达，CCl4模型对照组与BDL模型对照组α-SMA、CollagenⅠ蛋白呈阳性表达，较正常对照组差异有统计学意义(P<0.01)。CCl4+TFL组与BDL+TFL组中α-SMA、CollagenⅠ蛋白表达较各自的模型对照组有减弱，秩均值有下降，但下降不明显，差异无统计学意义。见表2。

表2 5 组大鼠α-SMA、CollagenⅠ免疫组织化学检测结果比较Tab.2 Comparison of immunohistochemical results of α-SMA and Collagen I among five groups of rats

2.4各组大鼠肝组织中α-SMA、NF-κBp65、COX-2蛋白的表达(Western blotting检测) 在CCl4模型中，TFL干预后，NF-κBp65与COX-2蛋白在肝脏中的表达量均较CCl4模型对照组有所降低(P<0.05);在BDL模型中，NF-κBp65、α-SMA与COX-2蛋白的表达量较模型对照组均显著降低(F=911.60，895.26，2386.42，P<0.05)。见图2—图4。故TFL在BDL模型中降低大鼠肝脏α-SMA表达的作用优于CCl4模型，而且在两种模型大鼠肝脏中NF-κBp65与COX-2蛋白的表达都显著降低。

A.正常对照组；B.CCl4模型对照组；C.CCl4+TFL组；D.BDL模型对照组；E.BDL+TFL组。图2 5组大鼠肝脏组织光镜HE和Sirius red染色结果(×200，n=8)A.normal control group；B.CCl4 model control group；C.CCl4+TFL group；D.BDL model control group ；E.BDL+TFL group.Fig.2 H&E staining and Sirius red staining on livers in five groups of rats(×200，n=8)

A.正常对照组；B.CCl4模型对照组；C.CCl4+TFL组；D.BDL模型对照组；E.BDL+TFL组。图3 5组大鼠肝脏组织光镜α-SMA、CollagenⅠ蛋白IHC染色结果(×200，n=8)A.normal control group；B.CCl4 model control group；C.CCl4+TFL group；D.BDL model control group ；E.BDL+TFL group.Fig.3 Immunohistochemistry(IHC) staining on α-SMA and CollagenⅠ in livers in five groups of rats(×200，n=8)

A.正常对照组；B.CCl4模型对照组；C.CCl4+TFL组；D.BDL模型对照组；E.BDL+TFL组。①与正常对照组比较，P<0.05；②与CCl4模型对照比较，P<0.05；③与BDL模型对照组比较，P<0.05。图4 5组大鼠肝组织α-SMA、NF-κBp65、COX-2蛋白表达(n=3)A.normal control group；B.CCl4 model control group；C.CCl4+TFL group；D.BDL model control group；E.BDL+TFL group.①Compared with normal control group，P<0.05；②Compared with CCl4 model control group，P<0.05；③Compared with BDL model control group，P<0.05.Fig.4 The protein expression of α-SMA、NF-κBp65 and COX-2 in livers in five groups of rats(n=3)

3 讨论

CCl4造模的肝纤维化大鼠属于化学损伤性肝纤维化模型[7]，其组织病理以肝细胞变性、坏死，假小叶形成为主，适合模拟临床化学药物损伤性肝病。胆管结扎造模的肝纤维化大鼠属于胆汁淤积性肝纤维化模型[8]，其组织病理以大量的新生胆管，胆汁淤积，细胞变性，炎症细胞浸润为主要改变，适合模拟临床胆管堵塞、寄生虫、先天胆管畸形等胆汁淤积性肝病。本研究选用两种常见的肝纤维化大鼠模型，从血清学指标、病理、分子指标比较一定剂量TFL对模型大鼠的作用。两种模型的发病原因不同、病理特征不同、临床表现也不同，但是TFL均可以减缓甚至逆转其肝纤维化的发展进程。可以为寻求“异病同治”、开发具有潜在抑制上皮间质转化靶点的药物提供基础[9]。

血清酶学ALT、AST是反映肝细胞是否损伤和坏死的主要指标[10-11]，当肝细胞受损时，ALT和AST升高。ALP被认为是胆汁淤积和胆道损伤的标志物[12]，血清ALP升高可提示胆汁淤积。研究表明，ALP还可评估胆汁淤积的预后情况[13]。本研究血清学结果表明，在降低ALT方面，TFL对CCl4模型的作用更为显著；在降低ALP方面，TFL对BDL模型的作用更为显著。在BDL模型中，脾指数和肝脏组织切片中胶原面积的降低更为显著。结果提示，在CCl4和BDL肝纤维化大鼠模型中，TFL均有较好的疗效。

HSCs的激活被认为是肝纤维化形成过程中的关键环节[6，14]，α-SMA的大量表达被认为是HSCs活化的标志[15]。本实验中免疫组织化学检测结果显示两种模型的α-SMA下降均不明显。而在Western blotting实验中，BDL模型中的TFL给药组下降较模型对照组显著。NF-κBp65被认为是多条炎症信号转导通路中的核心分子，NF-κBp65的活化可导致下游多种炎症因子的表达增强，加剧炎症损伤，长期的炎性刺激可导致肝脏纤维化[16-17]。本实验中两种肝纤维化模型给药组中的NF-κBp65下降均显著，故可推断TFL主要通过抑制NF-κBp65来发挥抗纤维化作用。COX-2是启动炎症反应、促进细胞增殖、抑制细胞凋亡的重要因子。COX-2在肝纤维化发生后表达普遍升高，使用COX-2抑制剂后，HSCs活化明显减少[18]。本实验中，在应用了TFL之后，COX-2的表达较各自的模型对照组均显著降低。表明TFL对COX-2有一定的抑制作用。TFL可能通过抑制COX-2来抑制HSCs的活化和增殖，从而达到抗纤维化的效果。

综上所述，TFL适用于CCl4诱导的肝纤维化大鼠和BDL肝纤维化大鼠，在CCl4模型中以降低血清酶学指标为主，在BDL模型中以降低淤胆状态为主，抑制NF-κBp65和COX-2蛋白的表达可能是其作用的分子机制。