pH值对酮洛芬体外透皮性能的影响

于秋菊，王晓丽

(1.徐州生物工程职业技术学院，徐州 221006；2.江苏省肿瘤医院药学部，南京 210018)

酮洛芬主要用于治疗风湿性、类风湿关节炎、骨关节炎和强直性脊椎炎等[1]。目前，国内外上市的剂型主要有片剂、胶囊剂、注射剂、栓剂、外用洗剂等。酮洛芬由于溶解度小，口服生物利用度低且长期服用会导致胃肠道刺激性[2]。经皮给药制剂的研究表明，其可以避免肝脏首关效应及胃肠道刺激性[3-4]。笔者通过对酮洛芬在不同pH值条件下的体外透皮速率研究，考察pH值条件对药物透皮速率及渗透系数间的关系，以指导酮洛芬微乳凝胶[5]的制备。

1 仪器与试药

1.1仪器 Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)；精密酸碱计(HM-60G)；药物透皮扩散实验仪(RYJ-12B)；循环水式多用真空泵(SHB-B88)；精密数显恒温水浴锅(J-HH-6A)；电子天平(千分之一，FA2204B)；超声波清洗器(US-22D)。

1.2药品与试剂 酮洛芬对照品(上海顺勃生物工程有限公司，批号：100177，含量：99.9%)；酮洛芬原料药(批号：160601，含量：99.54%，武汉祥和精细化工有限公司)；甲醇(一级色谱纯)；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸、正辛醇、无水乙醇、聚乙二醇、1，2-丙二醇、氢氧化钠均为分析纯。

1.3动物 豚鼠(徐州医科大学提供，批号：170622，豚鼠体质量约300 g)。动物许可证号：SCXK(苏)2012-0002，饲养环境温度18～25 ℃，湿度45%～55%，光照100 lx，给予豚鼠生长繁殖饲料，每天饮水2次。

2 方法与结果

2.1分析方法的建立

2.1.1色谱条件及专属性实验 参照文献[6]介绍的高效液相色谱(HPLC)法，结合酮洛芬理化性质，通过实验筛选出酮洛芬的色谱条件为：色谱柱：COSMOSIL 3C18-EB柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：pH值4.5磷酸盐缓冲液：甲醇=(18：72)；检测波长：258 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。在上述条件下，酮洛芬的保留时间约为7.1 min，柱效≥5000，空白不干扰药物测定。酮洛芬的高效液相色谱图见图1。

图1 空白与酮洛芬对照品的高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of blank solution and ketoprofen control

2.1.2标准曲线的绘制 精密称取的酮洛芬原料药0.005 0 g，置50 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，得浓度为100 μg·mL-1的储备液。精密量取储备液1.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL分别置20 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，用孔径0.45 μm滤膜滤过，按浓度由低到高进样分析。以峰面积A为纵坐标，浓度(C，μg·mL-1)为横坐标进行线性回归，回归方程为A=136.04C-45.003，r=0.999 2。结果表明：酮洛芬在5.0～50 μg·mL-1的范围内，线性关系良好。

2.1.3分析方法的确证 精密度实验：分别量取酮洛芬对照品储备液适量，配制酮洛芬线性范围内低、中、高3个浓度(约8.0，24.0，48.0 μg ·mL-1)的样品，于日内分别连续进样3次，测定不同样品的浓度，结果RSD值分别为1.94%，1.19%，1.08%，均小于2.0%，说明精密度良好。

稳定性实验：精密量取储备液3.2 mL，置于10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，摇匀，用孔径0.45 μm滤膜滤过，取20 μL续滤液分别于0，2，4，8，12，24 h测定峰面积，代入回归方程求出浓度，结果显示，RSD值为1.75%，即24 h内含量测定结果稳定。

回收率实验：精密量取储备液1.0，3.0，5.0 mL，用流动相稀释至刻度，摇匀，经孔径0.45 μm滤膜滤过，后用进样针取续滤液20 μL进样分析，以测得量与加入量比较，计算回收率，结果平均回收率分别为101.9%，102.69%，100.21%，RSD值分别为1.67%，1.51%，0.73%，表明回收率符合方法学要求。

2.2酮洛芬理化性质的测定

2.2.1溶解度的测定 为了研究pH值对酮洛芬透皮吸收的影响，本实验测定了酮洛芬在不同pH值条件下的溶解度[温度(32±1) ℃]，由于酮洛芬为一弱酸性药物，故而选择缓冲液的pH值分别为5.4，6.8，7.4，8.0，9.0。结果见图2。

图2 酮洛芬在不同pH值PBS中平衡溶解度比较(n=3)Fig.2 Equilibrium solubility of ketoprofen in PBS with different pH value(n=3)

由图2可知，酮洛芬的溶解度随着pH值的升高呈递增趋势，但在pH值8.0条件下小于pH值7.4的溶解度，可能是由于酮洛芬分子结构中同时带有羰基和羧基，但当处于pH值9.0的碱性环境中时，由于溶剂离子化效应增大，其溶解度又有所增高。

2.2.2酮洛芬表观油水分配系数(P)的测定 制备酮洛芬的饱和正辛醇溶液，精密量取该溶液2 mL置于具塞试管中，分别加入被正辛醇饱和过的纯化水、pH值5.0，6.8，7.4，8.0，9.0的缓冲液5.0 mL后，放入振荡器中，水浴温度(32±1) ℃，避光振摇24 h。离心，分离。分取上、下层溶液各10 μL进样，测定酮洛芬在水相(Cw)及油相中的浓度(Co)[7]。油水分配系数P用下式计算：

P=Co/Cw (1)

当采用不同pH值磷酸盐缓冲液为水相时，酮洛芬的P见图3所示。

图3表明，以纯化水为水相时，32 ℃下，酮洛芬在正辛醇/水体系中的油水分配系数为1.604，较小。随着水相pH值的增加，酮洛芬的油水分配系数迅速下降，可能是由于当药物以分子型存在时在水中的溶解度较小，油中溶解度较大，因为酮洛芬的解离常数为5.3，与5.4较为接近，也就是说酮洛芬在pH值为5.4的缓冲液中分子型比例最大，故而油水分配系数较大，且随着pH值的增加分子型比例逐渐减小，故而其油水分配系数随着pH值的增加而逐渐降低，在pH值为9.0时又有些微上升。

图3 酮洛芬在不同pH值磷酸盐缓冲液-正辛醇体系中的油水分配系数Fig.3 P value of ketoprofen in the system of phosphate buffer with different pH and n-octanol

2.3体外经皮渗透实验

2.3.1皮肤的选择与处理 取健康豚鼠，处死后剥离腹部皮肤，在0.4%硫化钠溶液中浸泡2 h，小心除去表面毛发及皮下脂肪、粘连的结缔组织等，继续在0.9%氯化钠溶液中浸泡30 min，清洗3遍，于-20 ℃保存备用[8]。

2.3.2接受液的筛选 由于酮洛芬在pH值7.4溶液中溶解度最大，但为了更好地满足漏槽条件[9]，在该缓冲盐中加入20%乙醇、20%丙二醇和20%聚乙二醇，以提高酮洛芬的溶解度，测量方法同“2.2.1”，结果酮洛芬的溶解度分别为852.34，631.67，428.46 μg ·mL-1。

可见，加入乙醇使溶解度增加较为显著，原因可能是乙醇为小分子且含有一个羟基，可部分与酮洛芬中的羧基结合为酯，从而大大增加溶解度。故选择20%乙醇-pH值7.4缓冲液作为接受液。

2.3.3累积渗透量的测定 本实验中，累积渗透量(Q)按公式(2)计算[10-11]：

cn为第n个取样点浓度，ci为第i个取样点浓度，A为扩散池面积，6.5为接收池容积。以Q为纵坐标，时间t为横坐标，进行线性回归，所得直线的斜率即为稳态渗透速率常数Js[12]( μg·cm2·h-1)。将Js除以酮洛芬在扩散池中药物的平衡浓度Cd( μg·mL-1)(由相应pH值时的溶解度转换出)可求得表观经皮渗透系数Ps(cm·h-1)，如公式(3)所示，

Ps=Js/Cd(3)

结果见表1。

表1 酮洛芬在不同pH值的体外透皮吸收动力学参数比较Tab.1 Comparison of kinetics parameters of ketoprofen in vitro transdermal absorption at different pH value

由表1可知，在pH值为7.4时，酮洛芬的Js和Ps最大，且与其溶解度成正比，与油水分配系数成反比，由此可见，pH值对酮洛芬透皮渗透性影响较大，药物溶解和扩散程度决定了药物经皮渗透的速率与程度。

2.4多元线性回归分析

2.4.1回归方程的假设检验及评价 以Js为因变量，pH值、S、P作为自变量，利用SPSS19.0版统计学软件进行多元线性回归分析。结果模型的R=1.000，R方=0.999，调整R方=0.997，标准估计的误差=5.884 773，P=0.034<0.05，表明所建方程有统计学意义。回归模型方差分析结果见表2。

表2 回归模型方差分析结果Tab.2 Results of variance analysis of regression model

由表2可知，所建立模型的变量均有统计学意义。

2.4.2多元线性回归方程的建立 方法同“2.4.1”项。结果见表3，可得到多元线性回归方程的回归系数。

表3 各因素回归系数Tab.3 Regression coefficient of each factors

自变量pH值的β1=-0.268，S的β2=1.099，P的β2=-0.141，即3个自变量对因变量Js的影响作用大小为S>pH>P。由多元线性回归得出的线性回归方程为Js=-19.635pH+1.686S-5.116P+92.121(n=5，R=1.000，s=5.885)，R=1.000，表示数据之间的相关性较好。

3 讨论

本实验通过测定酮洛芬在不同pH值PBS溶液中的溶解度及油水分配系数，并通过考察酮洛芬在不同溶媒中的溶解度，确定满足漏槽条件的接受液，通过测定酮洛芬在不同pH值PBS溶液中的体外透皮特性。结果表明，pH值对酮洛芬的理化性质与体外透皮性能均有很大影响，在pH值为7.4的PBS溶液中，酮洛芬可获得较高的溶解度、脂溶性及皮肤通透性，为酮洛芬微乳凝胶的制备奠定实验基础。

本研究回归分析结果表明，多元线性回归模型基本可以用于预测分析pH值、S、P与药物渗透活性的变化趋势，可以计算获得最佳pH值、S、P，可以通过辅料的加入改变药物的pH值，以调节酸式体与碱式体的存在比例，以改善药物的透皮吸收。