川芎嗪BCA-PLGA纳米粒的制备工艺研究

李冬静，李欣宇，杨 阳，封国溧，王志翀，张文君

(哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨 150076)

川芎嗪(tetramethylpyrazine, TMP)是一种来源于川芎中的有效活性单体成分生物碱，对脑血管疾病有多种保护和治疗作用[1]，在脑中风疾病中应用甚广[2].目前市售剂型主要有片剂、胶囊剂和注射剂，其中注射给药临床上使用最多[3-4].川芎嗪具有一定脂溶性，可透过血脑屏障，但其水溶性差，口服制剂在体内难以吸收，导致生物利用度低，为达到治疗浓度，须频繁给药易致蓄积川芎嗪浓度超过治疗窗甚至中毒，这一问题极大地限制了其开发应用.

聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)作为一类具有良好生物降解性和生物相容性的纳米载体材料，该材料进入人体后降解为人体内存在的乳酸和羟基乙酸，对人体无害已广泛应用于载药纳米粒的制备[5-6].

聚氰基丙烯酸正丁酯(polybutylcyanoacrylate, BCA)由于其生物相容性好、可降解性、释药持续性并有良好的控制释放、靶向投递等功能而备受重视[7-9].目前BCA作为载体将药物送入脑内，取得明显效果，是目前药物传输系统研究中的热点.因此，本实验以BCA-PLGA为载体，采用改良的乳化溶剂挥发法[10-11]和界面缩聚法[12-13]制备BCA-PLGA双包载川芎嗪纳米粒[14-15]，采用单因素试验考察处方及因素，正交优化确定制备工艺，以期制备包封率、载药量高的BCA-PLGA纳米粒，为研究川芎嗪纳米给药系统研究提供参考.

1 仪器和试药

1.1 仪器

紫外分光光度仪(UV-2021 PC型紫外可见分光光度计)；激光粒径测定仪(马尔文NanoZS 90，英国)；LE204E/02电子天平(梅特勒-托利多仪器上海有限公司)；79-2型双向磁力搅拌器(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司)；旋转蒸发仪(上海申胜生物技术有限公司).

1.2 药品

川芎嗪对照品(中国药品生物制品检定所)；川芎嗪(上海源叶生物科技有限公司)；聚氰基丙烯酸正丁酯(α-BCA，国药集团)；PLGA(50/50，相对分子质量20 000，济南岱罡生物工程有限公司)；聚乙烯醇(上海美梦佳化工科技有限公司)；甲醇(分析纯，西陇科学股份有限公司)；氢氧化钠(分析纯，天津市天力化学试剂有限公司)；盐酸(天津市协和昊鹏色谱科技公司)

2 实验方法与结果

2.1 TMP-BCA-PLGA纳米粒的制备工艺

TMP纳米粒的制备采用改良的自乳化溶剂挥发法结合界面缩聚法.取处方量的TMP、PLGA和BCA，精密称量，溶于3 mL丙酮的有机相中，配制质量分数2 % PVA(pH为5)的水溶液40 mL，作为水相.有机相缓慢加入水相中，常温800 r·min-1磁力搅拌2 h，0.1 mol·L-1NaOH调pH为7，除净有机溶剂，0.45 μm微孔滤膜过滤，即得TMP-BCA-PLGA纳米粒.

2.2 TMP-BCA-PLGA纳米粒的包封率测定

2.2.1 紫外分光光度法

精密称取5 mg TMP对照品于10 mL容量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，质量浓度为0.5 mg/mL的储备液，从中吸取0.05、0.1、0.2、0.3、0.4 mL用甲醇稀释并定容至刻度，配制成2.5、5、10、15、20 μg/mL一系列质量浓度的对照液，在波长295 nm条件下测定吸光度，以质量浓度(C)为横坐标，吸光度(A)为纵坐标，绘制标准曲线，结果显示川芎嗪在2.5～20 μg范围内成呈良好的线性关系，得回归方程为A=0.041 6C-0.008 5(r2=1).

2.2.2 TMP-BCA-PLGA纳米粒的包封率测定

精密量取TMP-BCA-PLGA纳米粒混悬液1 mL放置超滤离心管中，16 000 r·min-1离心30 min，精密量取外管液200 μL，于10 mL容量瓶中，用酸水稀释至刻度，按2.2.1项下方法测定游离的TMP的含量；精密量取TMP-BCA-PLGA纳米粒混悬液200 μL放置10 mL容量瓶中，用甲醇破乳后稀释至刻度，按2.2.1项下方法测定TMP-BCA-PLGA纳米粒中TMP的总含量，计算纳米粒中TMP的包封率.

2.3 TMP-BCA-PLGA纳米粒的粒径、Zata电位测定

取TMP-BCA-PLGA纳米粒混悬液，用纯化水稀释后，25 ℃放置激光粒径测定仪中，测定其粒径分布及Zeta电位值.

2.4 TMP-BCA-PLGA纳米粒的处方筛选

2.4.1 水相pH的确定

配制pH 1～7的水溶液，其他组分的处方量不变，平行制备TMP-BCA-PLGA纳米粒.按2.2.2项下测定包封率，按2.3项下测定粒径.结果见表1.

表1 水相pH对纳米粒粒径和包封率的影响(n=3)

由表1可知，pH对纳米粒粒径和包封率影响较大，pH为6时粒径最小，在pH 1～5范围内包封率随pH的增加而增大，分析原因可能是TMP为生物碱，在pH低的溶液中由于酸性太大，药物可能还没被聚合物包裹就有一部分被酸溶解而成盐，导致包封率降低.pH 6包封率较低，pH 7包封率小幅增加，综合粒径及包封率结果确定pH为5.

2.4.2 PVA型号及质量分数的确定

医药的PVA 有PVA05-88，PVA17-88，PVA-124等规格，考虑到PVA-124的聚合度较大，因此主要对PVA05-88，PVA17-88的型号进行筛选.固定pH为5，分别配制不同质量分数PVA 的溶液为水相，保持处方中其他组分的量不变，平行制备TMP-BCA-PLGA纳米粒.按2.2.2项测定包封率，按2.3项测定粒径.结果见表2.

表2 PVA型号及质量分数对纳米粒粒径和包封率的影响

由表2可知，同一质量分数不同型号的PVA，17-88的粒径比05-88的大，但包封率比05-88的高很多，因此确定型号为17-88，不同质量分数的PVA(17-88)溶液，随PVA质量分数的增加，粒径变化不是很大，包封率呈上升趋势，但在PVA质量分数为3%时，在液下注入时针孔附近聚集成球，分析原因可能是PVA质量分数较大，黏度增加，导致有机相进入水相速度减慢，不易扩散，从而聚集成球，综合粒径和包封率结果确定PVA质量分数为1%.

2.4.3 PLGA质量分数的确定

PVA(17-88)质量分数为1%，体系中pH为5，筛选PLGA(50/50, 相对分子质量20 000)质量分数为1%、2%和3%，保持其他组分的处方量不变，平行制备三份TMP-BCA-PLGA纳米粒混悬液.按2.2.2项测定包封率，按2.3项测定粒径.结果见表3.

表3 PLGA质量分数对纳米粒粒径和包封率的影响(n=3)

由表3可知，PLGA质量分数对纳米粒粒径影响不大，随PLGA质量分数的增加，包封率增大.分析原因可能是随着聚合物浓度升高，有机相的黏度增加，阻碍了TMP分散到纳米液滴中，导致包封率降低粒径变大，综合表3结果确定PLGA质量分数为2%.

2.4.4 BCA质量分数的确定

PVA(17-88)质量分数为1%，体系中pH为5，PLGA(50/50, 相对分子质量20 000)质量分数为2%，保持其他组分的处方量不变，筛选不同质量分数的BCA丙酮溶液，平行制备三份TMP-BCA-PLGA纳米粒混悬液.按2.2.2项测定包封率，按2.3项测定粒径.结果见表4.

表4 BCA质量分数对纳米粒粒径和包封率的影响

由表4可知，随着BCA质量分数的增加，粒径也随之增大，原因可能为质量分数增加单位体积与水中OH-聚合加快，同时不易扩散，附近的纳米粒由于聚集而使粒径增加所致，但包封率相差不大，综合粒径和包封率结果确定BCA质量分数为0.75%.

2.4.5 PLGA、BCA有机相加入体积比

固定pH为5，PVA型号为17-88，PVA质量分数为1%，PLGA质量分数为质量分数2%，质量分数0.75%的BCA丙酮液，保持处方中其他组分的量不变，平行制备TMP-BCA-PLGA纳米粒.按2.2.2项测定包封率，按2.3项测定粒径.结果见表5.

由表5可知，PLGA、BCA有机相加入体积比对包封率影响不是很大，但随着BCA加入体积的增加，粒径变大，分析原因可能为BCA与水中OH-发生聚合，药物被包封后，多余的BCA也发生聚合，进一步包裹纳米粒从而使粒径增加，综合考虑确定PLGA、BCA有机相加入体积比为1∶1.

表5 PLGA、BCA有机相加入体积比对纳米粒粒径和包封率的影响

2.4.6 有机相和水相体积比

固定pH为5，PVA(17-88)、PLGA、BCA丙酮液质量分数分别为1%、2%、0.75%，VPLGA∶VBCA比例为1∶1，保持处方中其他组分的量不变，平行制备TMP-BCA-PLGA纳米粒.按2.2.2项测定包封率，按2.3项测定粒径.结果见表6.

表6 有机相和水相体积比对纳米粒粒径和包封率的影响

由表6可知，有机相和水相比例对纳米粒粒径影响不大，但随着有机相和水相比例的增加，包封率逐渐增大，分析原因可能是水相比例增加，在注射器液下注入时，相同体积的有机相与水相接触面积增大，载体与水相发生聚合几率增大，同时水相液面高度适宜，这样有机相可以很好的扩散到水相以减小有机相进入水相，由于空间不足造成粒径变大的影响.而降低两相比例能显著增加纳米粒包封率，减少突释.综合以上因素确定有机相和水相的比例为1∶40.

2.5 处方的确定

根据2.4处方筛选结果表明最优处方：有机相和水相体积比为1∶40，PVA(17-88)质量分数为1%，体系中pH为5，PLGA(50/50, 相对分子质量20 000)质量分数为2%，BCA质量分数为0.75%，PLGA、BCA有机相加入体积比为1∶1.

2.6 优化处方纳米粒的表征

2.6.1 TMP-BCA-PLGA纳米粒的包封率

按照2.2.2 项下测定按照优化处方制备的3 批纳米粒的包封率，结果见表7.

表7 不同批次川芎嗪纳米粒包封率

2.6.2 TMP-BCA-PLGA纳米粒的粒径、Zata电位

取TMP-BCA-PLGA纳米粒，用纯化水稀释，25 ℃下用激光粒径测定仪，测定其粒径分布及Zeta电位值，见图1.TMP-BCA-PLGA纳米粒平均粒径为234.9 nm.

图1 川芎嗪纳米粒粒径图

3 讨 论

1)近年来，传统的药物剂型已不能满足人们的需求[6].本文采用改良的乳化溶剂挥发法和界面缩聚法制备TMP-BCA-PLGA纳米粒，PLGA作为药物载体材料优势为生物可降解相容性，而BCA也具有此性质、同时还具备释药持续性、低毒的特点，作载体能显著提高药物的生物利用度，并有良好的控制释放、靶向投递等功能.若单用BCA，由于BCA是在酸性条件下发生聚合，TMP为生物碱会造成其在酸性水相中溶解成盐而使药物的包封率降低，和PLGA合用主要考虑到其水相使用PVA溶液，黏度较大，可以减慢药物进入水相的速度，从而使TMP被PLGA包裹，之后再用BCA进行聚合，可以避免药物被酸性环境溶解，单用PLGA可能达不到药物靶向的作用，这样二者合用不仅可以减少药物在酸性水相中溶解同时可以发挥PBCA在靶向投递方面的作用.

2)川芎嗪为生物碱，pH对其影响因素较大，同时使用BCA及PLGA载体，BCA载体对pH也有一定的要求，主要与水中的OH-发生聚合进而包裹药物，若水相的pH过低，H+含量高，BCA的聚合太慢，会导致川芎嗪还没被包裹就被过高的酸性环境所溶解成盐，同时还不易形成纳米粒，pH过高，OH-浓度大，反应聚合太快，纳米粒容易聚集成球，PLGA在强酸强碱环境中容易降解，因此综合以上因素确定pH为5，既符合酸性条件BCA可以聚合，反应不至于太剧烈，又不会使PLGA在强酸性环境下而降解.

3)本文主要对处方进行筛选，但对PLGA的型号没有筛选，因有研究报道PLGA 50/50在体内降解较快，包封率较高[15].对反应时间、反应温度及转速以及PLGA与BCA加入时间进行考虑，后期会进一步研究.