葛根-黄芪药对的总黄酮提取及测定

赵闽家，杨娜娜，吴 迪，王 旭，孙文斌，徐蓓蕾*

(1.哈尔滨市食品药品检验检测中心，哈尔滨150025；2.哈尔滨商业大学 药学院，哈尔滨150076)

《证治汇补》里初次记载黄芪-葛根药对配伍，即黄芪葛根汤.此方需称取黄芪一两，野葛五钱，以水煎服，适用于气虚体弱，饮酒过多，体内虚热，脉搏微弱等症状，患者服后会有出汗的现象，逐渐好转[1-2].《医略六书》也曾记载黄芪-葛根配伍使用，以黄芪补人气血，提升阳气，用葛根增强机体免疫力，相辅相成，能发挥出极大药效[3].此外，黄芪与葛根的毒性副作用极低，安全性高，极受欢迎.

葛根主要活性成分是异黄酮类化合物和少量黄酮类物质，研究表明葛根中异黄酮类成分含量较高.异黄酮可分为苷类和甙类两类，前者包括葛根素、大豆苷等，后者主要指大豆苷、染料木素、香豆素和异甘草酸苷等.葛根素是目前中药葛根中被研究最多的活性成分，研究表明其对脑微循环系统具有良好的增益作用[4-6].现代临床表明葛根可降低血压、减缓心率、降低心肌耗氧量、并能有效减少血糖血脂，葛根中的活性成分具有较好的缓解心律失常的作用，且对自由基及其他相关物质具有良好的清除效果.黄芪的主要化学活性成分为黄芪多糖、皂苷和黄酮类化合物等，此外黄芪中还含有20余种氨基酸和多种微量元素，其中黄酮类的活性物质多达30余种[7-9].黄芪的活性成分对免疫系统有着极为显著的调节作用[10].实验发现，黄芪不仅可以改善非正常心血管的功能，对正常机体也可起到良好的保护作用，此外，黄芪还具有调节改善神经中枢，增益肝脏，调节、抑制肿瘤恶化，缓解病症等作用[11-12].

1 仪器与试剂

1.1 实验仪器

高速多功能粉碎机(天津泰斯特仪器有限公司)，数显恒温水浴锅(常州市恒久仪器制造有限公司)，98-1-B调温电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)，ISO9001分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)，T6 新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司).

1.2 实验材料

葛根，购于同仁堂药店，经哈尔滨商业大学曲中原教授鉴定为豆科植物野葛(Puerarialobata(Willd)Ohwi)的干燥根.黄芪，购于同仁堂药店，经哈尔滨商业大学曲中原教授鉴定为豆科植物蒙古黄芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)的干燥根.

1.3 实验试剂

芦丁标准品(中国食品药品鉴定研究所，批号：20170118)，水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯.

2 方法与结果

2.1 乙醇加热回流法提取工艺研究

2.1.1 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响

称取10 g葛根-黄芪粉末(古方配比1∶1)，在料液比为1∶10，提取温度为60 ℃，提取时间为2 h的条件下，分别考察乙醇体积分数为55%、65%、75%、85%、95%对总黄酮提取量的影响.结果显示当乙醇的体积分数达到85%时，总黄酮提取量最高，见图1.

图1 乙醇体积分数对总黄酮提取量的影响

2.1.2 提取时间对总黄酮提取量的影响

称取10 g葛根-黄芪粉末，使用65%的乙醇溶剂，在料液比为1∶10，提取温度为60 ℃条件下，考察提取时间在1、1.5、2、2.5、3 h条件下总黄酮提取量的情况.随着提取时间的延长，含总黄酮量逐渐升高，说明时间越久越利于总黄酮的溶出，2.5 h后总黄酮的提取量无明显增加，故选择适宜提取时间为2.5 h，见图2.

图2 提取时间对总黄酮提取量的影响

2.1.3 提取温度对总黄酮提取量的影响

取葛根-黄芪粉末10 g，使用65%的乙醇溶剂进行提取，置于45、55、65、75、85 ℃水浴锅中持续加热2 h，考察提取温度对总黄酮提取量的影响.结果表明总黄酮提取量随着提取温度的升高而逐渐上升，但由于乙醇沸点为78.31 ℃，且当温度过高时乙醇溶剂极易挥发，因此选适宜提取温度为75 ℃，见图3.

图3 提取温度对总黄酮提取量的影响

2.2 水煎煮法提取工艺研究

2.2.1 煎煮时间对总黄酮提取量的影响

取葛根-黄芪粉末10 g，加水浸泡30 min，料液比1∶20，水煎煮时间分别为30、60、90、120 min，提取次数2次，考察煎煮时间对总黄酮提取量的影响.随着水煎煮时间的增加，含总黄酮量也在增加，但是超过60 min后增加不大，且随着时间延长，提取产生的杂质增多，因此选择水煎煮时间为60 min，如图4.

图4 煎煮时间对总黄酮提取量的影响

2.2.2 液料比对总黄酮提取量的影响

取葛根-黄芪粉末10 g，用水浸泡30 min，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40，水煎煮时间60 min，提取次数2次，考察液料比对总黄酮提取量的影响，随着料液比的增加，含总黄酮量也在增加，当料液比1∶20时，得到的含总黄酮量趋于顶点，综合试剂成本及总黄酮提取量，故选择料液比1∶20，如图5.

图5 料液比对总黄酮提取量的影响

2.2.3 提取次数对总黄酮提取量的影响

取葛根-黄芪粉末10 g，用水浸泡30 min，在料液比为1∶20，水煎煮时间60 min条件下，考察不同提取次数，即分别提取1次、2次、3次对总黄酮提取量的影响.实验中先将提取液用4层纱布过滤，得到粗滤液后再用滤纸过滤，合并滤液.结果表明当提取次数为2次时得到含总黄酮量趋于顶点，第三次提取没有使含总黄酮量明显增加，并且增加成本，因此选择提取次数为2次，如图6.

2.3 葛根-黄芪总黄酮的测定

2.3.1 标准曲线的绘制

精密称取芦丁对照品5.00 mg，置50 mL容量瓶中，用60%乙醇溶解，定容.配制成质量浓度为0.1 mg/mL的对照品溶液.精密移取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL分别置于10 mL比色管中，用60%的乙醇稀释至5 mL，将5mL60%的乙醇作为空白对照组，并分别向其中加入5%的亚硝酸钠0.3 mL，充分摇匀，静置6 min.再加入10%的硝酸铝溶液0.3 mL，充分摇匀，静置6 min，再分别加入4%的氢氧化钠溶液4 mL，摇匀，用60%乙醇定容至刻度.摇匀，静置12 min后，在510 nm下测定.以芦丁对照品溶液的质量浓度(mg/mL)为横坐标，以吸光度为纵坐标，得回归方程为：Y=5.94X+0.022 4，R2=0.998 2.说明总黄酮质量浓度在0.01～0.05 mg/mL范围内与吸光度呈线性关系.

2.3.2 精密度考察

精密移取芦丁对照品溶液2 mL于比色管中，加60%乙醇稀释至5 mL后，同标准曲线制备，于510 nm 波长下测定吸光度值，重复测定6次，RSD为0.22%，表明本实验精密度良好.

2.3.3 重复性考察

用移液管移取芦丁对照品溶液2 mL于比色管中，加60%乙醇稀释至5 mL后，同标准曲线制备，于510 nm波长下测定吸光度值，重复测定6次，RSD为0.89%，表明重复性良好.

2.3.4 稳定性考察

选取芦丁对照品溶液，于0、2、4、6、8、10 h测定吸光度值，RSD为0.41%(n=6)，表明在10 h内稳定性良好.

2.3.5 加样回收率实验

吸取上述样品溶液10 mL加入上述制备的标准溶液3 mL(共6份)，黄酮平均加样回收率为96.92 %，测定结果在95%～105%范围内，RSD为4.44 %(n=18)，其值小于5%，结果表明本实验回收率良好.

2.3.6 葛根-黄芪总黄酮供试品的测定

准确称量0.050 0 g 样品置烧杯中，加入95%的乙醇10 mL溶解，完全溶解后将其置于25 mL容量瓶中，加5%NaNO2溶液1 mL，摇匀并静置6 min，再加10%Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀并静置6 min，再加4%NaOH溶液10 mL，95%的乙醇定容，摇匀并静置15 min，以水为参比溶液，用分光光度法在510 nm的波长处测定吸光度(A).由标准曲线方程得出，醇提含总黄酮类化合物量为2.74 mg/g，水提含总黄酮类化合物量为0.06 mg/g.

3 讨 论

水煎煮法是常见的传统提取方法，提取工艺简单，但其缺点较多，耗时长，杂质多，且易腐败变质，使后续的分离纯化难度增大[13-14].本实验结果表明，水煎煮法提取总黄酮得率远低于乙醇回流提取法总黄酮提取量，在实验中发现水煎煮法的提取液极难过滤，因为葛根黄芪中含有多糖成分，在提取中也会被一同提取出来，致使提取液杂质过多，黏性较大.综合考虑，不建议采用水煎煮提取方法.而乙醇加热回流法作为中药传统提取方法中最常用的提取方法，其提取工艺简单，成本较低，提取时间适当，杂质较少，易于分离，提取量相对较高，对比水煎煮提取法具有很大优势.

葛根黄芪药对的配伍从古至今得到了广泛的应用，研究表明总黄酮是葛根-黄芪提取物的主要有效成分[15].本实验通过单因素考察法对总黄酮的提取条件进行优化并采用紫外分光光度法测定葛根-黄芪药对提取物中含总黄酮量，进行方法学考察，得到良好的线性关系和方法回收率，可为葛根-黄芪药对的扩展应用提供依据.