基于单分子成像技术研究l-DNA 分子穿越微米通道端口的电动力学特性*
2020-08-29王琼王凯歌孟康康孙聃韩仝雨高爱华
王琼 王凯歌 孟康康 孙聃 韩仝雨 高爱华
1) (西北大学光子学与光子技术研究所, 国家级光电技术与纳米功能材料和应用国际研究中心, 省部共建国家光电技术与功能材料重点实验室培育基地, 陕西省光电子技术重点实验室, 西安 710069)
2) (西北大学物理学院, 西安 710069)
1 引 言
微/纳流控、微/纳液滴等技术集合了物理、化学、生物、计算机及纳米等前沿技术, 用于生化分析与检测[1−3]、医疗诊断[4,5]和食品安全[6]等重要领域, 能够对微量样品特性进行精准检测分析. 将微纳技术与可视化技术相结合, 在仿生环境中, 可对单个DNA 分子灵活操控、实时观测研究其动力学特性, 不但有助于揭示生命现象的基本规律, 而且在分子相互作用、纳米孔基因测序、药物输运及靶向治疗等方面具有广泛的应用前景[7−9].
操控单个DNA 分子, 将其有效导入、引导其穿越微纳通道是实现DNA 生物芯片众多功能的必备条件. 通常, 将DNA 分子顺利导入微通道的方法有: 流体力学进样[10](虹吸进样法、微通道端加压法、微通道末端抽真空法)、扩散进样[11]、电动力进样以及电渗驱动的流体进样[12]等方法. 流体力学进样法对所用设备有严格要求、装置复杂、设备体积大、成本高, 同时不利于分析黏度较大的样品; 扩散进样法引导样品进入通道内是被动的、且难以控制; 而电动力进样法相对容易控制,附加设备少、成本低, 在毛细管电泳分析中普遍采用.
目前, 电动力进样法将DNA 分子导入微纳通道仍存在尚未解决的关键问题. 例如, 随着外加电场强度的改变, DNA 分子在管口附近的动力学特性、速度分布以及DNA 本身的构象变化等不明确[13,14]; 而且, 电场力引导DNA 分子进入微纳通道时, 不断有新现象、新问题被发现.
Wang 等[15]曾利用可视化技术研究DNA 分子在微米通道内的电动力学特性, 发现DNA 分子从trans 端口进入内径为30 µm 通道时, 存在阈值电场强度.Yang 等[16]研究发现DNA 分子在外电场力作用下穿越5 和10 µm 的通道时, 其运动方向会发生反转, 并且, 微米通道管径越小, DNA 分子运动方向发生反转时的阈值电场强度越大. 最近, Jones 等[17]发明了一种微管收缩分选DNA 分子的装置, 采用电场力驱动DNA 分子运动, 通过改变电压的大小与频率调控DNA 分子在通道出口处的偏转方向, 成功实现了不同大小DNA 分子的筛选; 但是, 实验发现一部分分离后的DNA 分子吸附在通道的管壁上, 非常不利于芯片的持久运行.
本文利用单分子荧光成像可视化技术, 实时观察研究了l-DNA 分子在外加电场力作用下进/出微米通道端口的电动力学特性, 并基于微流体电动力学理论, 对DNA 分子在进入通道端口时的不同运动状态的物理机制进行了初步分析.
2 实 验
2.1 实验装置
实验装置如图1 所示, 主要包括: 倒置荧光显微 镜(IX-70, 奥 林 巴 斯, 日 本); EMCCD 相 机(iXon+885, Andor, 美国); 石英玻璃圆形微米通道(邯郸市鑫诺光纤色谱有限公司), 长度为5 mm,直径为50 µm; 铂丝电极(上海捷昱电子科技有限公司); 外接高压电源(PS 8000 2U, EPS, 德国).实验中, 电压调节范围为: 0—100 V. 图像数据采集、分析处理均用Image 软件(http://rsbweb.nih.gov/ij/). 整个实验在暗室中完成, 实验室温度控制为25 ℃.
图1 实验装置示意图Fig. 1. Schematic diagram of experimental set-up.
图1所示为实验的装置示意图. 实验具体步骤: 1) 导入缓冲液, 在cis 端口处滴入10 µl 的缓冲液, 2 s 左右缓冲液将充满整个微米通道; 2) 导入DNA 分 子, 将10 µl 浓 度 为0.455 mg/L 的DNA/YOYO-1 样品溶液滴在trans 端口, 样品通过毛细力作用进入微通道内; 3) 待溶液处于稳定状态, 调整电压, 确定电场强度大小与方向.
实验中, EMCCD 实时记录DNA 样品进入端口以及在微通道内运动情况, 其曝光时间设定为100 ms, 拍摄间隔为100 ms, 每次连续拍摄持续为5 min; EMCCD一次可以连续拍 摄1000 张照片.
2.2 样品液、微芯片的制备
实验使用的是l-DNA 分子(富酶泰斯生物技术公司, 深圳,中国), 用染料YOYO-1 分子进行标记. 为了保证最好的荧光效率, YOYO-1 染料分子插入l-DNA 分子的配置比例为DNA 碱基对:YOYO-1 分子 = 10 : 1.
样品溶液的制备过程如下所述: 1) 用移液枪移取100 µl 的Bis-tris (pH=8) 和1000 µl 的Tris-Hcl (pH = 8), 分别滴入标记为A 和B 的牛角管中; 2) 取0.411 µl 的DNA 原 液 和0.1 µl 的YOYO-1 原液分别加入A 和B 中, 摇匀A 和B 中的两种溶液使其充分混合, 置于暗室孵育30 min;3) 从B 中取200 µl 的YOYO-1 稀释液加入A 中充分混合, 在暗 室 中 孵 育30 min. 最终得到DNA/YOYO-1的混合溶液,DNA浓度为0.455 mg/L, 储藏在暗室中备用.
微通道芯片核心部分的制备, 简述如下: 1) 将经过PLL(20)-g(3.6)-PEG 溶液改性后的实验用微米通道烘干; 2) 将聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)颗粒与氯仿溶液按照1∶1 进行充分混合, 制备2 个样品池, 10 mm × 10 mm × 3 mm, 它们中间通过微米通道进行连接; 铂丝电极正对微通道端口处;3) 将聚酰胺树脂与环氧树脂按1∶1 混合后均匀涂抹在样品池的外围, 以加固结构; 将芯片系统放入烤箱, 温度60 ℃下烘烤两小时. 实验研究中, 为了避免DNA 分子被通道内壁表面吸附, 采用改性液PLL(20)-PEG(2)-PEG(3.4)对微米通道内壁进行改性处理. 本文所涉及的缓冲液pH 值都大于3,当溶液与二氧化硅通道壁面接触时, 其表面的硅烷醇(Si—OH)基团因去质子化而产生负电荷, 带正电的PLL(多聚赖氨酸)通过静电作用与去质子化的硅烷醇基团相结合, 吸附在通道壁面; 不带电的亲水性聚合物PEG(乙二醇), 有效阻止生物分子非特异性吸附到管道内壁上[18], 从而可以有效减小管壁对DNA 吸附. 实验所用改性混合液PLL 与PEG 的质量比 PLL∶PEG = 1∶3.6.
3 结果与分析
电场力驱动DNA 分子进入并穿越微米通道,影响DNA 分子在端口附近电动力学特性的主要因素有: 电场强度的大小、DNA 分子大小、DNA分子在微通道端口的位置、微米通道的性质、缓冲液的性质(浓度/PH)以及实验温度等条件. 本文主要研究电场强度对l-DNA 分子在50 µm通道端口处的电动力学特性的影响.
3.1 DNA 分子顺利穿越微米通道的电场强度阈值
微米通道两端施加电压, 实验发现: 当电场强度E < 1.875 × 103V·m–1时, 距离trans 端口大约为100 µm 范围内的样品池内未捕捉到DNA 分子, 表明DNA 分子很难靠近trans 端口; 当电场强度E = 1.875 × 103V·m–1时, 样品池内的DNA分子开始缓慢靠近trans 端口, 但未进入trans 端口; 当电场强度增大到E = 2.5 × 103V·m–1时,DNA 分子开始进入trans 端口; 随后, 逐渐增大电场强度, DNA 分子能够进入trans 端口并顺利穿越通道, 并从cis 端口顺利离开; 当E > 7.5 ×103V·m–1时, 从trans 端口进入通道的DNA 分子迁移至cis 端口附近时, 部分DNA 分子发生反转运 动, 即, DNA 分 子 的 运 动 方 向 发 生 逆 转, 由cis 端向trans 端运动, 不能够从cis 端口穿出. 可见, DNA 分子能够从trans 端口进入并且顺利穿越微通道, 电场强度大小有合适范围, 存在阈值:Emin= 2.5 × 103V·m–1, Emax= 7.5 × 103V·m–1.
如图2 所示, 当电场强度E = 3.75 × 103V·m–1时, DNA 分子从trans 端口进入微米通道并在管内的迁移.
图2 DNA 分子从trans 端口进入微米通道并在内部迁移(E = 3.75 × 103 V·m–1) (a) 不同时间下的CCD 照片;(b) DNA 分子位置随时间的变化曲线Fig. 2. DNA molecules enter the microchannel from the trans port and migrate inside (E = 3.75 × 103 V·m–1): (a)CCD photographs; (b) DNA molecular position.
由图2(a)可见, 当外加电场在阈值电场强度内, DNA 分子能够顺利进入trans 端口, 其中有2 个DNA 分子进入观察视野范围内, 分别用虚线椭圆和虚线菱形标识; A1~D1和A2~B2分别对应DNA1和DNA2分子在不同时刻出现在微米通道内的位置, 可以发现: 1) DNA 分子在通道内运动时, DNA1和DNA2分子到微米通道中心轴向的距离L1< L2, 其大小基本不变; 2) DNA1分子在trans 端口附近运动时(从A1位置到B1位置), 进入trans 端口之前是纠缠蜷缩的(A1位置), 进入通道内, 渐渐被拉伸, 长度增大, 但在微米通道内拉伸长度变化不大; 3) 图2(b)是DNA 分子在通道内迁移时位置的改变, DNA1分子在0—0.5 s 内移动距离为65.5 µm, 0.5—1.0 s 内移动距 离为94.0 µm, 1.0—1.5 s 内移动距离为153.0 µm, 其平均速度逐渐增大; 而DNA2分子在被捕捉时已经进入到微通道内, 0—0.5 s 内移动距离为70.0 µm,与DNA1分子刚进入端口时运动的距离几乎相同.
实验中, 还观察到DNA 分子进入trans 端口后, 其速度会逐渐增大, 而DNA 分子穿出cis 端口时的速度逐渐减小等现象. 图3 所示为DNA 分子进入trans 端口和穿出cis 端口时的速度随时间的变化曲线.
图3(a)为DNA 分子进入trans 端口的速度随时间的变化. 其中DNA1, DNA2和DNA3分子分别表示距离中心轴线不等的三个DNA 分子, 距中心轴线的距离为L1< L2< L3, 速度关系为v1>v2> v3. 可见, DNA 分子从样品池进入trans 端口之前的速度较小, 一旦进入trans 端口开始加速,进入微米通道中部后速度比较平稳; 轴线附近的DNA 分子速度大于管壁附近的DNA 分子速度.图3(b)为DNA 分子流出cis 端口时的速度随时间的变化特性, 实验数据是从DNA 分子距离cis 端口大约为100 µm 的位置处开始记录的,DNA 分子距离中心轴线的距离为L4< L5< L6
对比图3(a)和图3(b), DNA 分子进入trans端口与DNA 分子流出cis 端口的速度变化几乎是两个反对称的过程. 在通道端口附近的同一横截面处, 中心轴线附近的DNA 分子速度变化快, 而管壁附近的DNA 分子速度变化慢. DNA 分子进入trans 端口时, 速度逐渐增大, 最后保持不变; 穿出cis 端口时, 速度逐渐减小, 最终进入样品池中的速度大小基本相同, 其主要原因是DNA 分子在样品池中的运动主要受布朗运动的影响.
图3(c)为DNA 分子在进入端口和离开端口处的速度随着外加电场变化的曲线图, 规定DNA 分子逆着电场方向的运动为正方向. 图3(c)所示是在不同的电场强度下, 分别对通道进/出端口随机捕捉的30—50 个DNA 分子的平均速度,DNA 分子距离中心轴线的范围为0—14 µm. 其中, 黑色曲线为DNA 分子刚好进入端口的平均速度随着外加电场强度的变化关系, 红色曲线为DNA 分子刚好离开端口处的平均速度随着外加电场强度的变化关系. 由图3(c)可知, 当电场强度2.5 × 103V·m–1< E ≤ 7 × 103V·m–1时, DNA在入端口速度小于出端口速度; 当外加电场强为7 × 103V·m–1< E ≤ 1 × 104V·m–1时, DNA 在入端口的速度大于出端口速度.
图3 DNA 分子进出端口的速度随时间的变化(E = 3.75 ×104 V·m–1) (a) 进入trans 端口; (b) 穿出cis 端口; (c) 速度随外加电场强度的变化关系Fig. 3. The velocity of DNA molecules entering and leaving the port (E = 3.75 × 103 V·m–1): (a) Entering the trans port; (b) leaving the cis port; and (c) velocity versus electric intensity.
3.2 DNA 分子的反转运动
继续增大电场强度, 当电场强度E > 7.5 ×103V·m–1时, 发现DNA 分子从trans 端口进入微米通道内, 运动至cis 端口附近时将出现部分DNA 分子反转运动, 即, 运动方向发生改变, 如图4所示.
图4 DNA 分子在微通道内的反转运动 (a) E = 8.125 ×103 V·m–1; (b) E = 9.375 × 103 V·m–1; (c) 不同电场 强 度下, 在cis 端口不同区域内的DNA 分子反转数占总数的百分比Fig. 4. Reversed motion of DNA molecules within micro channel under different electric intensity: (a) E = 8.125 ×103 V·m–1; (b) E = 9.375 × 103 V·m–1; (c) percentage of DNA molecules with reversal motion direction in different regions of the cis port under different electric intensity.
图4 所示为DNA 分子在不同电场力作用下穿越微米通道时, 其运动方向发生反向的情况. 如图4(a)所示, 当外加电场强度E = 8.125 × 103V·m–1时, DNA 分子首先在通道内沿trans→cis 方向运动(0—0.4 s 内), 速度逐渐减小; 当DNA 分子运动至cis 端口处时, 将在径向上迁移, 而在轴向上近似静止(0.4—0.6 s 内); 最后, DNA 分子运动方向发生反转, 沿cis→trans 方向运动(0.6—1.0 s内), 速度逐渐增大. 如图4(b)所示, 当电场强度继续增大至E = 9.375 × 103V·m–1, DNA 分子未到达cis 端口的边界处就开始反转, 即, 在0—0.5 s内, DNA 分子沿trans→cis 方向运动, 逆着电场方向运动; 0.5—1.2 s 内, DNA 分子沿cis→trans 方向运动, 顺着电场方向运动.
为了详细研究在不同的电场强度下DNA 分子的反转运动沿管径方向的变化, 对微通道进行了划分, r 为距离中心轴线的距离, C 区域为0 ≤r1< 14 µm, S1区 域 为14 µm ≤ r3< 20 µm,S2区域为20 µm ≤ r2≤ 25 µm. 同一电场强度下, 当DNA 分子运动稳定后统计10 min. 在不同外加电场强度下重复实验, 发现每次实验捕捉到的各个分区域内DNA 分子数目占DNA 分子总数的百分比分布基本相同, 例如, 当电场强度为7.5 ×103V·m–1时, DNA 分子分布在C, S1 和S2 各区域内的平均百分比分别约为68%, 23%和9%.图4(c)所示是随机的3 次实验, 外加不同电场强度时, 发生在不同区域的反转DNA 分子数占所捕捉的DNA 分子总数的百分比. 由图4(c)可知, 在不同的外电场强度下, DNA 分子流出端口不同区域的反转数占流出总数的百分比不同. 随着电场强度的增大, DNA 分子反转的几率增大, 在相同的电场强度下, C 区域内DNA 分子的反转概率最小,其次是S1 区域, S2 区域内DNA 分子的反转概率最大.
随着电场强度的继续增大, DNA 分子运动方向发生反转的位置距离cis 端口越来越远, 离trans 端口越来越近; 当E = 1 × 104V·m–1时, 通道trans 端口附近的内壁上会吸附DNA 分子; 当E > 1 × 104V·m–1时, 部分DNA 分子刚进入trans 端口内就发生反转运动, 返回到trans 端的样品池中, 或者被吸附到管壁上.
DNA 分子的反转运动方式可以分为基本的两种类型: 1) DNA 分子首先逆着电场的方向运动至cis 端口; 然后, DNA 分子在反转点的位置径向迁移, 轴向上静止; 最后, DNA 分子开始反转, 朝向trans 端口运动; 2) DNA 分子首先逆着电场的方向运动, 在未到达cis 端口时收缩成一个紧凑的小球, 似乎停止在通道中; 最后, DNA 分子直接反转运动. 其中, 距离中心轴线较远的DNA 分子容易发生第一种类型的反转运动; 而中心轴线附近、或者管壁附近的DNA 分子, 或者当电场强度大于9.375 × 103V/m 时, DNA 分子容易发生第二种类型的反转运动.
3.3 DNA 分子的往复运动以及旋转运动
当电场强度增大至E > 9.375 × 103V·m–1时, 在trans 端口附近, 发现DNA 分子具有周期性往复运动的现象.
如图5(a)所示, 当电场强度E > 9.375 ×103V·m–1时, 在trans 端口附近, 单个DNA 分子在一个周期内的往复运动, 周期约为3.0 s, 其中,红色箭头表示DNA 分子的运动方向.
图5 DNA 分子在trans 端口附近沿轴向的运动 (a) 往复运动; (b) 旋转运动Fig. 5. The motion of DNA molecules near the trans port:(a) Reciprocating along the axis; (b) rotating.
如图5(b)所示, 当电场强度E = 1×104V/m时, 捕捉到多个DNA 分子的往复运动, 分别用圆形虚线、菱形虚线标记. 其中, 黄色箭头表示单个DNA 分子(圆形虚线标记)在轴向上往复运动的方向, A1—A5表示DNA 分子在不同时刻的位置,它在轴向上的运动距离较大, 自身无旋转; 红色箭头表示团聚在一起的多个DNA 分子(菱形虚线标记)绕着自身旋转的方向, 其方向指向管壁(顺时针旋转), B1—B5表示DNA 分子在不同时刻的位置, 团聚的DNA 分子在轴向上往复运动的距离较小, 蓝色虚线表示DNA 做往复运动时的平衡位置.
图6 是图5(b)中团聚的DNA 分子在10 s 内往复运动的轨迹. 其中, 蓝色曲线为DNA 分子运动的轨迹, 红色虚线为DNA 分子在运动过程中平衡位置的拟合曲线, 图中两点之间的时间间隔为0.1 s.
图7 所示为通道trans 端口附近的内壁上吸附DNA 分子的情形, 图7(a)和图7(b)的电场强度分别为7.5 × 103和1 × 104V·m–1, 由图7 可知, 随着电场强度的增大, 吸附在内管壁的DNA 分子数量增多.
图6 DNA 分子在trans 端口附近的往复运动(E = 9.375 ×103 V·m–1)Fig. 6. The track of DNA molecules reciprocating near the trans port (E = 9.375 × 103 V·m–1).
图7 不同电场强度下的trans 端口附近通道内壁团聚有DNA 分子 (a) E = 7.5 × 103 V·m–1; (b) E = 1 × 104 V·m–1Fig. 7. Aggregates of DNA molecules on the wall of microchannel near the trans port; (a) E = 7.5 × 103 V·m–1;(b) E = 1 × 104 V·m–1.
3.4 DNA 分子进/出微通道端口机制
图8 所示是流体在通道内的速度分布以及DNA分子的受力和运动示意图. 由于微米通道端口处存在反压差, 通道内流体速度是电渗流和反压差流的叠加, 流体的流速不再是理想的塞状分布[19].
图8 中, 灰色带箭头的线段表示流体的速度分布, 流体在通道trans/cis 端口的速度是顺着电场方向的电渗流流速与逆着电场方向的泊肃叶(Poiseuille)抛物线流速的叠加. 流体在径向上存在速度梯度; 另外, 由于端口处存在明显的反压差作用以及可能存在的污染、管口不平整等因素, 缓冲液沿轴向也存在速度梯度.
图8 缓冲液在微米通道内的流速分布以及DNA 受力和速度示意图 (a)受力; (b)速度Fig. 8. Schematic diagram of buffer velocity distribution in microfluidic channel and the infromation of DNA: (a) Force;(b) velocity.
如图8(a)所示, DNA 分子在trans/cis端口处沿轴向的受力为
沿径向的受力为
DNA 分子在微通道内部只受到沿轴向的作用力, 其大小为
图8 中,f1=f电泳力=qE;f2,f3分 别 为 轴向流体阻力和径向流体阻力, 其大小为f流体阻力=6πaµ(vf−vp) , 其方向与速度矢量差的方向相同;, 反压差力也是由压强梯度引起的; 萨夫曼力的大小为fs=Kµ(vf−vp)a2|G/υ|1/2. 式中,q为DNA 分子的带电量,E为电场强度,a为DNA 分子的半径,vf,vp分别为流体的速度和DNA 分子的速度,µ表示流体黏度,u为流体运动黏度,G为局部流体速度梯度,∂p/∂x为轴向的压强梯度.
当DNA 分子与壁面之间的距离很近时存在静电作用, 其大小为[20]
其 中k−1为德拜长度;kB玻尔兹曼常量;y1为DNA 分子到管壁的距离;zwall和zDNA分别为壁面Zate 电势和DNA 的表面电势, 与DNA 的带电量和缓冲液的PH 有关.
由(1)式和(2)式可知, DNA 分子所受合力的大小与外加电场强度、缓冲液速度、DNA 分子大小、DNA 电泳速度、管径大小等因素有关.
图8(b)是流体和DNA 分子在通道中的运动示意图. 实验中使用的缓冲液pH > 3, 与管壁接触时管壁带负电; 当微米通道两端施加电场时, 微通道内的缓冲液将形成电渗流, 其移动方向为cis→trans; 由于DNA 分子显负电性, DNA 分子电泳的方向与电渗流方向相反, 为trans→cis. 理想状态下, DNA 分子等带电粒子在微米通道中运动的速度是电泳[21,22]和电渗流[23,24]的叠加. 规定DNA 分子电泳速度方向为正, 则DNA 分子在微通道中运动的有效速度veff为
当微米通道长度为无限长的理想情况时, 流体在微通道中的速度可以用电渗流速度来表示, 即,vf=εζwallE/4πµ. 然而, 实际的微米通道为有限长,通道端口流体的速度是电渗流和反压差流动速度的叠加, 即[20,25]:
其中e是溶液的介电常数;ψ(y2) 为距离中心线为y2处的电势;h为通道的半径.
实验中, 样品池的边长(L= 10000 µm)相对于微通道的内径(D= 50 µm)以及DNA 分子的回转半径(Rg= 0.7 µm), 几乎是一个三维无限大的储液池. DNA 分子在样品池内将处于纠缠状态,当其从trans端口进入通道, 是逆着流体流动的方向迁移, DNA 分子进入以及穿越微米通道的过程中始终受到一个逆向流体的作用力[26].
研究发现[15], 电场力驱动DNA 分子从trans端进入并顺利穿越内径为30 µm 的通道时, 最小阈值电场强度为Emin= 7 × 103V·m–1. 本研究发现, DNA 分子从trans端口进入并顺利穿越内径为50 µm 通道时的最小阈值电场强度Emin= 2.5 ×103V·m–1. 即, 通道内径越小, 电场强度阈值越大.这种现象符合电渗流压力同湿周长度C与通道截面积A的比值成正比的规律[27].
由(6)式与(7)式可得, DNA 分子在微米通道内同一横截面上的有效速度:
(8)式等号左侧的第二项为定值, 因此,DNA 分子的有效速度与径向距离y2的关系是开口向下的抛物线, DNA 分子沿轴向的有效速度在中心轴线处将最大.
图9 所示是DNA 分子在流出端口同一截面不同位置处沿轴向速度的实测数值与理论计算值.其中, 横坐标为DNA 分子距离中心轴线的距离,dp/dx= 0.04 Pa/m,µ= 1.011 × 10–3Pa·s,y2=4.5, 13.5, 22.5 µm,蓝色曲线为理论DNA 分子速度, 红色曲线为实测速度. 从图9 可以明显看出, 随着DNA 分子距离中心轴线越远, 其轴向有效速度越小; 理论与实验相吻合.
图9 DNA 分子在端口同一截面不同位置的实测速度与理论速度Fig. 9. Measured and theoretical velocities of DNA molecules at different positions on the same cross section of near the microchannel port.
外加电场不同, DNA 分子在通道内出现不同的运动状态, DNA 的反转运动主要出现在cis端口, 往复运动和旋转运动出现在trans端口.
图10 所示为DNA 分子从trans端口进入微米通道, 并随着电场强度的改变, 在端口附近其反转运动发生位置点变化示意图. 图10(a)和图10(b)为DNA 分子在不同电场强度下的反转运动过程.其中, 图10(a)的电场强度范围为7.5 × 103V·m–1≤E≤ 1 × 104V·m–1, 图10(b)的电场强度范围为E> 1 × 104V·m–1.
图10 DNA 分子在微米通道内端口附近处的反转运动示意图 (a) DNA 分子在cis 端口处反转, 反 转后的DNA 分子容易吸附在微米通道内管壁上, 7.5 × 103 V·m–1 ≤ E ≤1 × 104 V·m–1; (b) DNA 分子在trans 端口附近的反转运动, E > 1 × 104 V·m–1Fig. 10. Schematic diagram of DNA molecules moving near the port of microchannel: (a) reversing near the cis port,and the reversed DNA molecule is easy to be adsorbed onto the inner wall, 7.5 × 103 V·m–1 ≤ E ≤ 1 × 104 V·m–1; (b)reversing near the trans port, E > 1 × 104 V·m–1.
由图10(a)可知, DNA 分子是逆着流速靠近cis端口. DNA 靠近cis端口, 其电泳力和电渗流阻力几乎不变, 流体的阻力虽然逐渐减小, 但压强梯度力却逐渐增大, 导致DNA 分子的运动速度逐渐减小. 图10(a)中用虚线圆标记了一个在cis端口将要反转的DNA 分子所处的位置, 此时, 压强梯度力与DNA 分子表面的电渗流阻力之和大于DNA 分子所受电泳力, 使得DNA 开始反转运动.
电场强度的大小能够影响DNA 分子反转点的位置. 当外电场达到反转电场强度时, 电场强度越大, DNA 分子速度减小越快, 反转运动之前沿trans→cis方向运动的距离越小, 距离cis端口处越远. 如图10(b)所示, 外加电场强度E> 1 ×104V·m–1,菱 形 标 记 的 一 个DNA 分 子 靠 近trans端口, 此时, DNA 分子受力满足条件:f电泳力+f压强梯度力+f反压差力>f轴向流体阻力+f电渗流阻力, 因此它能够进入trans端口. 当DNA 分子进入通道内部, 运动到圆虚线标记的位置时, 反压差力和压强梯度力很小, 甚至消失, 电泳力不足以主导DNA 分子继续迁移, 此时DNA 分子在电渗流阻力的主导下反转运动, 沿cis→trans的方向运动.需要说明的一点是, 外加电场的增大会产生焦耳热, 进而引起缓冲液的黏度减小; 而且, 在散热的过程中, 微米通道沿径向有温度梯度, 将影响微通道内部流体的速度分布, 对DNA 分子的运动也会产生影响.
另外, 电场强度越大对DNA 分子构象的影响较明显, 使其表面电荷分布发生改变. 如图5(a)所示, DNA 分子在构象上高度压缩, 其表面电荷密度将发生改变; 图5(b)所示, 电场强度超过1 ×104V/m, DNA 分子收缩成一个相当紧凑的小球,导致DNA 分子表面电荷密度分布发生改变, 各向同性增强[28], 表面电势(zDNA)发生变化将导致DNA 分子电泳力发生改变[29]. 图5(a)中, DNA 分子逆着流体的方向进入通道, 在1.0 s 时刻, DNA分子未到达cis端口, 但是其有效速度已减小为零.由于在该电场强度下, DNA 分子的电渗流淌度大于电泳淌度, 使得DNA 分子不能保持静止状态,因此下一刻DNA 分子的运动方向开始反转, 转向cis→trans运动. 当到达trans端口附近时, 有效速度再次减小为零(2.0 s 时刻), 此时DNA 分子的受力 为f电泳力+f压强梯度力+f反压差力>f电渗流阻力, 导致DNA 分子不能流出trans端口, 在此位置再一次进行反转, 转向trans→cis运动, 形成一次往复运动.
电场强度继续增大, 并不能促使DNA 分子在电泳的主导下向着cis端管口迁移, 反而加快DNA 分子往复运动的频率. DNA 分子在往复运动的过程中, 偏向管壁运动时速度减小. 由图6 可以看出, DNA 分子在往复运动的过程中逐渐地靠近管壁, 同时DNA 分子往复运动的轴向距离逐渐减小. 当电场强度E> 7.5 × 103V·m–1时, DNA 分子明显偏向管壁运动, 主要原因是在trans端口附近, 反压差的作用使得DNA 分子周围的流体存在速度梯度, 受到萨夫曼力的作用[30], 方向指向管壁.关于DNA 分子的旋转运动, 则主要是由于DNA 分子周围的缓冲液在径向和轴向上都存在速度梯度. 当团聚的DNA 分子质量较大时, 就有可能出现径向位置变化较小的旋转运动. 如图5(b)所示, 中心轴线右侧团聚的DNA 分子周围的流体存在速度梯度, 距离中心轴线越近流体速度越小,此时DNA 分子向着管壁处旋转; 当DNA 分子的旋转角速度矢量与运动的速度矢量不重合时, 在与旋转角速度矢量和平动速度矢量组成的平面相垂直的方向上将产生一个径向力, 即, 马格努斯力[31].萨夫曼力和马格努斯力之间存在互动性; DNA 分子将在以上多种力的共同作用下做复杂的旋转运动.
4 结 论
本论文利用单分子荧光显微成像方法比较系统地研究了l-DNA 分子在外电场力作用下进入、穿越内径为50 µm 的圆形通道的电动力学特性.研究结果表明: DNA 分子能够进入微米通道trans端口并顺利穿越微通道存在最小阈值电场强度Emin= 2.5 × 103V·m–1和最大阈值电场强度Emax= 7.5 × 103V·m–1. 只有当外电场强度满足2.5 × 103V·m–1≤E≤ 7.5 × 103V·m–1时, 才能够引导DNA 分子从trans端口进入通道, 并顺利从cis端口穿越. 当外电场小于Emin时, DNA 分子只能靠近trans端口, 但不能通过trans端口进入通道; 外加电场强度7.5 × 103V·m–1
