白花九里明提取物中3种有机酸及总黄酮、总有机酸的含量测定

韩 璐，黄薏霏，那袭雪，张文涛，宋 丹，杨 宏，宁小清，*

(1.广西中医药大学，广西 南宁 530001；2.广西南宁市妇幼保健院，广西 南宁 530000)

壮药白花九里明来源于菊科艾纳香属植物东风草(Blumeamegacephala(Randeria)Chang et Tseng)的地上部分[1]。研究表明，白花九里明药材含有原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸[2]以及有机酸、黄酮类化合物等止血成分[3]；白花九里明提取物对小鼠子宫平滑肌具有明显收缩作用[4]。为了进一步弄清白花九里明提取物中的有效成分及其含量，作者采用高效液相色谱法和酶标法对提取物中的原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、总黄酮[5-6]、总有机酸[7]的含量进行测定。

1 实验

1.1 药材、试剂与仪器

白花九里明药材，采自南宁市郊，经广西中医药大学药学院宁小清高级实验师鉴定为菊科艾纳香属植物东风草(Blumeamegacephala(Randeria)Chang et Tseng)的地上部分。

原儿茶酸对照品、绿原酸对照品、咖啡酸对照品，中国食品药品检定研究院；乙腈、磷酸，色谱纯；甲醇、乙醇，分析纯；超纯水。

e2695型高效液相色谱仪，美国Waters；SQP型电子天平，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司；Milli-Q型超纯水系统，美国Millipore；P300H型中型超声波清洗机，德国Elma Schmidbauer GmbH；Infinite M200PRO型光吸收微孔板检测仪，奥地利Tecan Austrla GmbH。

1.2 白花九里明提取物的制备

取干燥的白花九里明药材1.5 kg，加水超声提取，过滤；滤液浓缩后加入乙醇使醇含量为70%～85%，静置，过滤，滤液干燥后即得白花九里明提取物146.25 g。

1.3 色谱条件

Inert Sustain C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相为乙睛-0.1%磷酸(8∶92，体积比，下同)；流速1.0 mL·min-1；柱温30 ℃；进样量10 μL。检测波长250 nm和327 nm：0～10 min，327 nm；10～20 min，250 nm；20～45 min，327 nm。典型图谱见图1。

图1 对照品(a)和白花九里明提取物(b)的HPLC图谱

1.4 对照溶液的制备

分别精密称取原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸对照品适量，配成3种有机酸质量浓度分别为0.174 mg·mL-1、0.200 mg·mL-1、0.071 mg·mL-1的混合对照溶液，供HPLC分析使用；精密称取槲皮素对照品适量，配成0.082 4 mg·mL-1槲皮素对照溶液，供酶标分析使用；精密称取原儿茶酸对照品适量，配成0.216 mg·mL-1原儿茶酸对照溶液，供酶标分析使用。

1.5 供试溶液的制备

精密称取白花九里明提取物约0.5 g，置于10 mL棕色容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，超声10 min后于3 000 r·min-1离心15 min，取上清液，用0.45 μm微孔滤膜过滤，即得供试溶液，供HPLC分析使用。

精密称取白花九里明提取物70 mg，置于100 mL容量瓶中，加入1%三氯化铝溶液4 mL，用70%甲醇定容，供酶标法测总黄酮使用。

精密称取白花九里明提取物70 mg，置于100 mL容量瓶中，加入50%甲醇60 mL、0.3%SDS溶液20 mL、1%铁氰化钾-三氯化铁溶液10 mL，用0.1 mol·L-1HCl溶液定容，供酶标法测总有机酸使用。

2 结果与讨论

2.1 原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸的含量测定

2.1.1 线性关系

取混合对照溶液，分别进样2 μL、4 μL、6 μL、8 μL、10 μL、12 μL、14 μL、16 μL、18 μL,按色谱条件测定, 记录峰面积。以峰面积(y)为纵坐标、进样量(x)为横坐标绘制标准曲线，拟合得线性回归方程：原儿茶酸：y=3247876.3x-161259.7(R2=0.9999)，线性范围0.348～3.132 μg；绿原酸：y=2366620.2x-153803.1(R2=0.9999)，线性范围0.4～3.6 μg；咖啡酸：y=2138932.2x-76685.8(R2=0.9999)，线性范围0.142～1.278 μg。

2.1.2 精密度

精密吸取混合对照溶液10 μL, 按色谱条件连续进样6次。计算原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸峰面积的RSD(n=6)分别为0.39%、0.40%、0.37%，表明仪器精密度良好。

2.1.3 稳定性

精密吸取供试溶液，按色谱条件分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h进样测定。计算原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸峰面积的RSD分别为1.72%、0.78%、1.82%，表明供试溶液在24 h内稳定性较好。

2.1.4 重复性

精密称取同一供试品6份, 按1.5方法制备供试溶液, 按色谱条件进样测定。计算原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸峰面积的RSD(n=6)分别为1.77%、0.98%、1.60%,表明该方法重复性良好。

2.1.5 加标回收率

按1.5方法平行制备6份供试溶液，每份精密加入原儿茶酸对照品、绿原酸对照品、咖啡酸对照品0.696 mg、1.000 mg、0.210 mg，制成样品溶液。分别进样测定，计算加标回收率，结果见表1。

从表1可知，原儿茶酸平均加标回收率为98.07%，RSD为1.35%；绿原酸平均加标回收率为97.49%，RSD为1.42%；咖啡酸平均加标回收率为99.81%，RSD为0.43%。

表1 3种有机酸的加标回收率(n=6)

2.1.6 含量测定

根据方法学考察, 原儿茶酸在0.348～3.132 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系；绿原酸在0.4～3.6 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系；咖啡酸在0.142～1.278 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。其精密度、稳定性、重复性及加标回收率的RSD值均符合含量测定要求。测得白花九里明提取物中原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸的含量分别为1.29 mg·g-1、3.68 mg·g-1、0.81 mg·g-1。

2.2 总黄酮的含量测定

2.2.1 线性关系

精密量取槲皮素对照溶液1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL，分别置于10 mL容量瓶中，各加入4 mL 1%的三氯化铝溶液，用70%甲醇定容，吸取100 μL，测定溶液在373 nm处吸光度。以吸光度(y)为纵坐标、槲皮素浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，拟合得槲皮素线性回归方程为：y=10.933x-0.0151(R2=0.9998)，线性范围8.24～41.20 μg·mL-1。

2.2.2 精密度

精密量取槲皮素对照溶液100 μL，连续检测6次。计算RSD(n=6)为0.171%，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性

精密称取同一供试品6份，按1.5方法制备供试溶液，取100 μL检测。计算RSD(n=6)为0.94%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 稳定性

精密量取供试溶液100 μL，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h检测。计算RSD为2.14%，表明供试溶液在24 h内稳定性较好。

2.2.5 加标回收率

精密称取供试品35 mg，按1.5方法平行制备6份供试溶液，精密加入0.78 mg槲皮素对照品，制成样品溶液。精密量取各样品溶液100 μL检测，计算加标回收率，结果见表2。

表2 槲皮素的加标回收率(n=6)

从表2可知，槲皮素的平均加标回收率为102.4%，RSD为0.75%。

2.2.6 含量测定

根据方法学考察, 槲皮素在8.24～41.20 μg·mL-1浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系。测得白花九里明提取物中总黄酮含量为22.33 mg·g-1。

2.3 总有机酸的含量测定

2.3.1 线性关系

精密量取原儿茶酸对照溶液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL，分别置于10 mL容量瓶中，各加入50%甲醇6 mL、0.3%SDS溶液2 mL、1%铁氰化钾-三氯化铁溶液1 mL，暗处静置5 min，用0.1 mol·L-1HCl溶液定容，再暗处静置20 min，吸取50 μL测定溶液在292 nm处吸光度。以吸光度(y)为纵坐标、原儿茶酸浓度(x)为横坐标绘制标准曲线，拟合得原儿茶酸线性回归方程为：y=8.5188x+2.1548(R2=0.9999)，线性范围10.8～54.0 μg·mL-1。

2.3.2 精密度

精密量取原儿茶酸对照溶液50 μL，连续检测6次。计算RSD(n=6)为0.36%，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性

精密称取同一供试品6份，按1.5方法制备供试溶液，精密吸取50 μL检测。计算RSD为1.92%，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性

精密量取供试溶液50 μL，分别在0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h检测。计算RSD为1.32%，表明供试溶液在24 h内稳定性较好。

2.3.5 加标回收率

精密称取供试品35 mg，按1.5方法平行制备6份供试溶液，精密加入6.657 mg原儿茶酸对照品，制成样品溶液。精密量取各样品溶液50 μL检测，计算加标回收率，结果见表3。

表3 原儿茶酸的加标回收率(n=6)

从表3可知，原儿茶酸的平均加标回收率为101.1%，RSD为1.07%。

2.3.6 含量测定

根据方法学考察,原儿茶酸在10.8～54.0 μg·mL-1浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系，测得白花九里明提取物中总有机酸含量为190.92 mg·g-1。

2.4 讨论

采用HPLC法测定白花九里明提取物中的原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸的含量。对甲醇-0.1%磷酸(20∶80)、甲醇-水(20∶80)、乙腈-水(8∶92)和乙腈-0.1%磷酸(8∶92)等4种流动相进行了比较研究，发现以乙腈-0.1%磷酸(8∶92)为流动相时，白花九里明提取物的色谱峰分离度较好，无拖尾现象。

酶标法具有样品和试剂用量少、速度快、效率较紫外可见分光光度法高等特点。因此，采用酶标法测定白花九里明提取物中总黄酮和总有机酸的含量，其中，总黄酮含量测定采用三氯化铝显色法，总有机酸含量测定采用铁氰化钾-三氯化铁显色法。结果表明，三氯化铝显色法和铁氰化钾-三氯化铁显色法适用于白花九里明提取物中总黄酮和总有机酸的含量测定,具有简便、快速、准确、可靠等优点。

3 结论

建立了白花九里明提取物中原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、总黄酮和总有机酸含量的测定方法。采用双波长切换高效液相色谱法测定原儿茶酸、绿原酸和咖啡酸的含量，原儿茶酸在0.348～3.132 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(R2=0.9999)，平均加标回收率为98.07%，RSD为1.35%；绿原酸在0.4～3.6 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(R2=0.9999)，平均加标回收率为97.49%，RSD 为 1.42%；咖啡酸在0.142～1.278 μg范围内与峰面积呈良好的线性关系(R2=0.9999)，平均加标回收率为99.81%，RSD为0.43%。白花九里明提取物中原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸的含量分别为1.29 mg·g-1、3.68 mg·g-1、0.81 mg·g-1。采用酶标法测定总黄酮和总有机酸的含量，发现槲皮素在8.24～41.20 μg·mL-1浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系(R2=0.9998)，平均加标回收率为102.4%，RSD为0.75%；原儿茶酸在10.8～54.0 μg·mL-1浓度范围内与吸光度呈良好的线性关系(R2=0.9999)，平均加标回收率为101.1%，RSD为1.07%。白花九里明提取物中总黄酮和总有机酸含量分别为22.33 mg·g-1和190.92 mg·g-1。该方法简便、准确、重复性好，可作为白花九里明提取物中原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、总黄酮和总有机酸的含量测定方法。