羧甲基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖复合海绵的制备与性能评价

2020-08-28许楗桢雷琪琪张文柠敖宁建

化学与生物工程 2020年8期

李洁，许楗桢#，胡萍，雷琪琪，张文柠，敖宁建,2*

(1.暨南大学生命科学技术学院，广东广州 510632；2.广东省教育厅生物材料重点实验室，广东广州 510632)

人体最大的器官——皮肤，它能最大程度地保护人体免受病原体及疾病的侵害，防止体液流失[1]。皮肤受伤经6周无法治愈可能会受到病原菌的感染形成微生物膜[2]，从而转变为慢性伤口[3]。皮肤慢性伤口是一项重要的医疗保健问题[4]，以糖尿病足溃疡为典型代表。据报道[5]，约25%的糖尿病患者会患上足溃疡。导致皮肤慢性伤口的因素很多，主要有微生物感染、循环障碍、糖尿病和外伤瘢痕等[6]。理想的伤口敷料不仅需要保持伤口透气、湿润且能抵抗微生物[7]，还可通过提高细胞增殖来增强人体的再生能力[8]。

魔芋葡甘聚糖(KGM)分子量较小、溶解度较大[9]，还具有生物安全性、凝胶性、生物相容性、保水性、生物可降解性等优良性能[10]，且高碘酸钠氧化的KGM避免了常用氧化法的缺点[11-12]。羧甲基壳聚糖(CMCS)无定型，易溶于任何pH值的水溶液中[13]，且具有保湿、免疫原性低、生物降解速度快、抗氧化剂、抗微生物等优异特性[14-15]。

目前，国内关于氧化魔芋葡甘聚糖(OKGM)的研究较少。因此，作者设计并研制一种新型医用敷料的初形——羧甲基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖(CMCS/OKGM)复合海绵，通过吸水率、孔隙率、透气率、对NIH-3T3细胞增殖的影响、抗菌能力、急性全身毒性等测试来评价复合海绵的性能。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

SPF级KM小鼠，广州江高文毅公司。

魔芋葡甘聚糖(KGM，纯度≥95%)，湖北强森魔芋科技有限公司；羧甲基壳聚糖(CMCS，取代度≥80%)、氘代水(D2O)，上海麦克林生化科技公司；高碘酸钠，分析纯，天津大茂化学试剂厂；溴化钾，光谱纯，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；PBS缓冲液，武汉普诺赛生命科技有限公司；CCK-8 试剂盒，上海贝博生物科技有限公司。

LGJ-12型真空冷冻干燥机，北京松源华兴科技发展有限公司；Lab Serv K3型酶标仪，赛默飞世尔科技(中国)有限公司；RE-2000A型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂；Tensor27型傅立叶红外光谱仪、Bruker AV 500MHz型核磁共振波谱仪，德国Bruker公司；EVO MA 15型扫描电子显微镜，德国卡尔蔡司公司；101-1型恒温鼓风干燥箱，金坛华龙实验仪器厂。

1.2 氧化魔芋葡甘聚糖的制备

称取5.0 g KGM，置于500 mL去离子水中，搅拌至均一体系；加入6.0 g高碘酸钠，持续搅拌下于暗环境、30 ℃水浴24 h；再加入2 mL乙二醇，反应2 h以除去过量的高碘酸钠；然后将混合液旋转浓缩至溶液总体积的1/3；透析72 h后，取上清液，离心，旋转，干燥，研磨成粉末状，即得OKGM。

1.3 氧化魔芋葡甘聚糖的结构表征

1.3.1 FTIR分析

以溴化钾压片为背景扫描；取少量KGM粉末和OKGM粉末，采用压片法按1∶100的比例分别与溴化钾混合研磨，制成片剂，通过傅立叶红外光谱仪进行FTIR测试。

1.3.21HNMR分析

称取一定量的KGM和OKGM，按10∶1(mg∶L)的比例分别溶解在D2O中，完全溶解后，用移液管移取适量溶液于干净的核磁管中，通过核磁共振波谱仪进行1HNMR测试。

1.4 羧甲基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖复合海绵的制备

称取一定量CMCS粉末，溶于去离子水中，配制成质量浓度为5%的CMCS溶液；称取一定量OKGM粉末，溶于去离子水中，配制成质量浓度为5%的OKGM溶液，静置脱泡。将上述两种溶液分别按配比(CMCS与OKGM的体积比)10∶0、8∶2、5∶5、2∶8混合，加入2%(以混合体系质量计)的甘油，搅拌均匀，倒入干净的聚四氟乙烯培养皿中，静置30 min进行交联反应；反应完毕，用保鲜膜盖住培养皿以密封，置于4 ℃冰箱中1 h，再置于-30 ℃冰箱中过夜；经冷冻干燥，即得4种不同配比的CMCS/OKGM复合海绵，分别记为CMCS/OKGM-0、CMCS/OKGM-2、CMCS/OKGM-5、CMCS/OKGM-8，CMCS/OKGM-0即为CMCS海绵。

1.5 羧甲基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖复合海绵的结构表征

1.5.1 FTIR分析

对CMCS/OKGM复合海绵进行FTIR测试，分析其化学键的变化情况。以溴化钾压片为背景扫描；将CMCS/OKGM复合海绵进行充分干燥处理后，用研钵将其研成粉末，并采用压片法按1∶99的比例与溴化钾混合研磨，制成片剂，通过傅立叶红外光谱仪进行FTIR测试。

1.5.2 SEM分析

将4种不同配比的复合海绵用手术刀裁剪成5 mm×5 mm×2.5 mm(厚)的块状，用导电胶将其固定在铜板上，送样，通过扫描电子显微镜测试复合海绵的微观形态。

1.6 羧甲基壳聚糖/氧化魔芋葡甘聚糖复合海绵的性能评价

1.6.1 吸水率测定

将4种不同配比的复合海绵切成相同大小的矩形条，于60 ℃干燥箱中烘干至恒重，待其冷却至室温后称重(W0，g)；随后置于100 mL生理盐水中浸泡3 min，静置于洁净斜台上沥干水分，用滤纸吸干表面多余的水分后称重(W1，g)。每组实验平行测定3次，取平均值，按式(1)计算吸水率(W，%)：

(1)

1.6.2 孔隙率测定

采用称重法测定孔隙率。在200 mL烧杯中装满水，称重(M1，g)；倒掉一部分水后放入一定量(M，g)复合海绵，待复合海绵充满水后补足水称重(M2，g)；将复合海绵从烧杯中取出，对剩余水分和烧杯再进行称重(M3，g)。每组实验平行测定3次，取平均值，按式(2)计算孔隙率(P，%)：

(2)

1.6.3 透气率测定

将4种不同配比的复合海绵置于恒温鼓风干燥箱中，烘干至恒重；同时将30 mL蒸馏水放入细口瓶中后称重；在瓶口涂满凡士林，将恒重复合海绵放在瓶口处(注意将瓶口周围用密封条密封)；24 h后取出复合海绵，再次称量细口瓶与蒸馏水总质量。每组设3个平行，每个平行测定3次，取平均值，按式(3)计算透气率(ε，g·cm-3·h-1)：

(3)

式中：m1、m2分别为透气前后细口瓶与蒸馏水的总质量，g；t为测试时间，h；r为细口瓶的半径，cm；h为复合海绵的厚度，cm。

1.6.4 对NIH-3T3细胞增殖的影响

慢性伤口敷料必须具备的功能是增强表皮成纤维细胞的增殖，从而加快慢性伤口的愈合速度。因此，通常以成纤维细胞的增殖情况作为判断伤口敷料的有效性依据[16]。以KM小鼠胚胎成纤维细胞(NIH-3T3)为研究对象，按照GB/T 16886.5-2003《医疗器械生物学评价》第5部分[17]，采用CCK-8试剂盒测试4种不同配比的复合海绵中NIH-3T3细胞的增殖情况[16]。NIH-3T3细胞液为培养24 h、48 h、72 h的细胞液，用酶标仪测定450 nm处吸光度(OD)，按式(4)计算细胞生长速率(G)：

(4)

1.6.5 抗菌能力测试

以革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichiacoli)和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为供试菌，采用抑菌圈法测试CMCS海绵及CMCS/OKGM-5复合海绵的抗菌能力。样品量5 mg，24 h后观察抑菌效果，用高清设备拍照记录。

1.6.6 急性全身毒性测试

迟立超课题组[18]曾研究过CMCS的毒性，认为CMCS拥有比壳聚糖更好的生物安全性。本研究按照GB/T 16886.11-2011《医疗器械生物学评价》第11部分[19]，采用腹腔注射法测试CMCS/OKGM-5复合海绵的生物安全性。将CMCS/OKGM-5复合海绵浸提液分离纯化，按50 mL·kg-1的标准剂量将0.9%的复合海绵浸提液注射到KM小鼠腹腔中，以注射生理盐水作为对照，分别在注射后第1 d、第3 d和第7 d记录KM小鼠的体重、运动量、食物摄入、肠蠕动、呼吸频率、健康状况等。若KM小鼠在注射后7 d内生理活动正常，没有中毒或死亡且体重稍有增长，则判定CMCS/OKGM-5复合海绵具有生物安全性。

1.7 数据处理

运用SPSS 19.0软件对实验数据进行统计处理。实验数据全部按均值±标准差进行处理，并且使用方差的单因素分析来检验数据组间差异的显著性。

2 结果与讨论

2.1 FTIR分析(图1)

从图1a可以看出，KGM在3 415 cm-1处有一个强而宽的吸收峰，为多糖结构的-OH吸收峰；1 735 cm-1处为乙酰基的C=O吸收峰；1 653 cm-1处为水分子的面内吸收峰[20]。OKGM在1 693 cm-1处有一个新的吸收峰，为醛基吸收峰，证明了氧化反应的发生[16]。KGM 880 cm-1处和OKGM 886 cm-1处为β-D-糖苷键结构的吸收峰，证明了KGM的主链结构在氧化过程中没有改变[16]。

从图1b可以看出，CMCS/OKGM复合海绵在1 030 cm-1处有一个一级醇羟基吸收峰，而在1 693 cm-1处的醛基吸收峰消失，证明CMCS上的氨基和OKGM上的醛基发生了化学交联反应；CMCS、CMCS/OKGM、OKGM均在3 200～3 500 cm-1处存在多糖结构的-OH吸收峰，其中CMCS/OKGM的吸收峰向右移动并且信号增强，表明CMCS上的氨基已经发生化学反应，并且很可能两者同时产生氢键。

图1 KGM、OKGM、CMCS、CMCS/OKGM的FTIR图谱

2.2 1HNMR分析(图2)

图2 KGM、OKGM的1HNMR图谱

从图2可以看出，由于中性体系的影响，δ8.40～δ9.40处烯醇CH的质子信号小到几乎看不到，故看到KGM分子中没有醛基。此外，在OKGM的1HNMR中，与水化醛基和聚缩醛连接的醛基的质子显示为δ4.65～δ5.50之间的信号；而在KGM的1HNMR中，醚键的质子显示为δ2.20和δ3.70，这表明OKGM通过半缩醛和缩醛在分子间和分子内发生交联。从理论上来看，高碘酸盐氧化可使KGM的邻位羟基断裂，形成双醛衍生物OKGM。假设每个α-乙二醇基团消耗一分子高碘酸盐，使得KGM氧化以获得理论上的氧化度，那么，OKGM实际醛含量表明氧化度为(17.20±0.21)%[18]。而本研究中实际OKGM的氧化度为烯醇CH的质子与醚键所连的质子之比(即取代度)，用MestReNova软件对相应峰面积积分，计算得到OKGM的实际氧化度为27%，较KGM大幅提高。其氧化以后，CMCS上的氨基和OKGM上的醛基发生化学交联反应。

2.3 SEM分析(图3)

a～d:CMCS、CMCS/OKGM-2、CMCS/OKGM-5、CMCS/OKGM-8

从图3可以看到，CMCS海绵的孔洞形状扁平内陷、不够饱满(图3a)，导致其回弹性很差，机械性能一般；而在加入OKGM后(图3b、c、d)，OKGM与CMCS发生化学交联，且随着OKGM添加量的增加，复合海绵的交联度相应增大，孔洞越来越密集、分布均匀且饱满。表明，OKGM的加入大大改善了CMCS海绵的内部微观孔洞结构，故初步判定所制备的CMCS/OKGM复合海绵具有优异的吸水率、孔隙率和透气率等性能。

2.4 吸水率分析(图4)

图4 CMCS/OKGM复合海绵的吸水率

从图4可以看出，CMCS海绵具有较好的吸水性，吸水率高达180%；当加入OKGM后，由于交联度的影响，复合海绵吸水率随OKGM添加量的增加先升高后降低，在CMCS与OKGM配比达到5∶5时，CMCS/OKGM-5复合海绵的吸水率达到最高，为270%。因此，CMCS/OKGM-5复合海绵拥有更优异的吸水率。

2.5 孔隙率分析(图5)

图5 CMCS/OKGM复合海绵的孔隙率

从图5可以看出，4种海绵的孔隙率均超过92%，且随着OKGM添加量的增加，孔隙率先升高后降低。这是因为，OKGM作为交联剂加入到CMCS体系中形成了复合海绵的孔洞结构，孔隙率相比于CMCS海绵有所升高；但随着体系交联度的继续增大，复合海绵的孔洞越来越密集，孔隙率反而下降。CMCS、CMCS/OKGM-2、CMCS/OKGM-5、CMCS/OKGM-8海绵的孔隙率分别为93.34%、97.19%、95.45%、94.48%，其中CMCS/OKGM-2复合海绵的孔隙率最高，CMCS/OKGM-5复合海绵次之。

2.6 透气率分析(图6)

图6 CMCS/OKGM复合海绵的透气率

从图6可以看到，透气率与孔隙率的变化趋势相似，均表现为随OKGM添加量的增加先升高后降低，CMCS/OKGM-2复合海绵的透气率最高，CMCS/OKGM-5复合海绵次之。这是因为，与CMCS海绵相比，加入OKGM后，CMCS/OKGM复合海绵的孔洞结构显著增加，导致透气率明显升高[16]，在CMCS与OKGM配比达到8∶2时，透气率达到最高；但随着OKGM添加量的继续增加，交联度会继续增大，复合海绵的孔洞越来越密集，透气率相应降低。因此，CMCS/OKGM-2和CMCS/OKGM-5复合海绵能确保伤口处的气体交换，有利于伤口愈合[16]。

2.7 对NIH-3T3细胞增殖的影响(图7)

图7 CMCS/OKGM复合海绵对NIH-3T3细胞增殖的影响

从图7可以看到，培养24 h、48 h、72 h的NIH-3T3细胞在CMCS/OKGM-2和CMCS/OKGM-5复合海绵中的增殖率均超过了90%，且高于在CMCS海绵中的增殖率；但是在CMCS/OKGM-8复合海绵中的增殖率明显降低，甚至低于在CMCS海绵中的增殖率。这是因为，OKGM的加入有利于NIH-3T3细胞活性的提高，但当OKGM添加量过多时，未交联的OKGM保留在培养基中，破坏了营养液的平衡，NIH-3T3细胞活性略有下降，导致增殖率下降。当CMCS与OKGM配比为5∶5时，所制备的CMCS/OKGM-5复合海绵最有利于NIH-3T3细胞的增殖[16]，能促进表皮细胞增殖，使伤口愈合。

2.8 抗菌能力分析(图8)

A、A1为CMCS海绵；B、B1为CMCS/OKGM-5复合海绵

从图8可以看出，所制备的CMCS/OKGM-5复合海绵对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均表现出明显的抗菌能力，抑菌圈直径均大于7 mm。表明，CMCS/OKGM-5复合海绵具有较好的抗菌性能，符合医用伤口敷料的基本要求。

2.9 急性全身毒性分析

腹腔注射CMCS/OKGM-5复合海绵浸提液后，第1 d、第3 d、第7 d测试的KM小鼠体重见表1。

表1 KM小鼠的急性全身毒性试验体重变化

从表1可知，第1 d，CMCS/OKGM-5组和生理盐水组的KM小鼠体重差别不大；第3 d、第7 d，两组的KM小鼠体重逐渐增加，这与复合海绵对NIH-3T3细胞增殖影响的结论一致：CMCS/OKGM-5复合海绵对NIH-3T3细胞的增殖效果最佳。表明CMCS/OKGM-5复合海绵具有较好的生物安全性，但相比于生理盐水组，CMCS/OKGM-5组的KM小鼠体重增幅小些，说明CMCS/OKGM-5复合海绵有略微毒性。

2.10 外观形貌分析(图9)

a.外观 b.向内弯曲 c.向外弯曲

从图9可以看出，CMCS/OKGM-5复合海绵的表面蓬松且凹凸不平(图9a)，可有效覆盖创面；CMCS/OKGM-5复合海绵具有很好的柔韧性(图9b、c)，可适用于关节处创面的粘附，并且其厚度适中，其间有均匀分布的蓬松小孔，有助于研发后期的载药性复合海绵敷料。

2.11 讨论

皮肤慢性伤口以糖尿病足溃疡为典型代表[3]，通常是由于组织水肿、炎症、伤口不易愈合、伤口面积大所致，渗液形成的不良微生物膜会很大程度地阻碍慢性伤口愈合，还会干扰生长因子、阻碍药物作用并且会加重创面及周边的炎症反应。一旦出现皮肤缺损，伤口就开始感染、化脓，接着病变成反复性伤口——“溃疡”，即使经过长时间治疗也不易愈合，甚至还会恶性发展为坏疽(足病)而导致截肢[21]。临床上对于糖尿病足溃疡的治疗手段比较复杂，带给患者生理及心理上的极大病痛和生活困扰[22]。故针对糖尿病足溃疡这类慢性伤口，医用敷料必须具有良好的透气性、吸液性、无毒、抗菌性，能作为缓释药物载体且可促进细胞增殖，能保持在对创面有利的湿润环境下吸收更多的不良渗液，减少微生物所致的感染及炎症反应。

本研究选用的CMCS、OKGM是天然生物材料，有着较高的生物相容性。研究表明，CMCS在细胞间相互作用使细胞增殖，从而达到伤口愈合的目的[23-24]。在结构性能方面，CMCS/OKGM复合海绵有分布均匀的孔洞结构，使得复合海绵拥有优良的吸水率、孔隙率及透气率，有利于吸收伤口渗液并且保持伤口处的气体交换，避免了渗液积留在伤口表面给不良微生物创造生长环境造成感染，从而保证伤口愈合的环境[25]，符合医用级伤口敷料标准。在抗菌方面，CMCS表现出很强的抗菌性[26]，本研究也证明了所制备的CMCS/OKGM-5复合海绵具有优异的抗菌能力。在细胞增殖方面，由于CMCS的两性电解质特性使得成纤维细胞能够很好地贴附材料生长[27]，极大地促进NIH-3T3细胞增殖，使得慢性伤口能很好地愈合，NIH-3T3细胞增殖影响试验与急性全身毒性试验结果也表明CMCS/OKGM-5复合海绵有极好的生物安全性。

CMCS/OKGM复合海绵可以负载不同的药物成分来加速伤口愈合，具有很大的开发潜力和临床价值。本研究运用SPSS 19.0软件对实验数据进行统计分析，统计学结果P<0.05，具有统计学意义，数据有效。本研究未对伤口止血进行探讨，有待进一步完善。