克雷白氏杆菌(Klebsiella pneumoniae Tzyx1)降解对羟基苯甲酸的调控基因及降解途径分析

于红艳，张昕欣，娄 欢，王苏玲

(1.台州职业技术学院医学与制药工程学院，浙江 台州 318000；2.台州市质量技术监督检测研究院，浙江 台州 318000)

对羟基苯甲酸是重要的有机合成原料，也是对羟基甲苯、联苯、多环芳烃等多种芳香化合物生物代谢的中间产物[1]，广泛应用于化工、塑料、食品、医药及染料工业中[2]。近年来不断有研究指出，对羟基苯甲酸具有雌激素活性[3]，它们通过各种途径进入环境[4]，对水体、土壤和大气造成污染，并逐渐威胁到人类健康[5]。由于对羟基苯甲酸具有很强的抑菌作用，所以对对羟基苯甲酸污染的修复特别是生物修复具有较大的难度[6-7]。对羟基苯甲酸降解菌株的好氧降解途径主要包括:邻位途径[8]、间位途径[8]、龙胆酸途径[9]和原儿茶酸途径。目前已知的菌株对对羟基苯甲酸的降解速率及降解效率不甚理想[10-11]，菌株在降解对羟基苯甲酸时的基因结构及表达量变化也未见相关的研究报道。

作者采用平板划线法从台州市某印染废水中筛选高效对羟基苯甲酸降解菌株，对其形态及生理生化特性进行分析，用cDNA文库构建的方法对其纯培养和对羟基苯甲酸胁迫的基因进行比较分析，查找降解对羟基苯甲酸的调控基因并推测降解途径，以期为对羟基苯甲酸污染的生物修复提供理论依据。

1 实验

1.1 试剂与培养基

对羟基苯甲酸，购于上海麦克林生化科技有限公司，用丙酮配成1.0 g·L-1的母液，经0.22 μm有机滤膜过滤除菌，备用；其它试剂均为分析纯。

葡萄糖基础培养基：硫酸铵0.2%，柠檬酸钠0.1%，七水合硫酸镁0.02%，磷酸氢二钾0.4%，磷酸二氢钾0.6%，蛋白胨0.1%，葡萄糖0.2%，pH值7.2。

对羟基苯甲酸胁迫培养基：硫酸铵0.2%，柠檬酸钠0.1%，七水合硫酸镁0.02%，磷酸氢二钾0.4%，磷酸二氢钾0.6%，蛋白胨0.1%，pH值7.2；灭菌后加入对羟基苯甲酸丙酮母液，使终浓度为200 mg·L-1。

1.2 菌株的筛选与分离

取适量某印染废水作为菌源水体，置于葡萄糖基础培养基中25 ℃摇床培养3 d；取富集培养液1 mL接种于对羟基苯甲酸胁迫培养基中，于25 ℃、200 r·min-1摇床培养4 d；将培养物稀释涂布于固体无机盐培养基上，25 ℃培养至有肉眼可见的明显菌落长出；在固体无机盐平板上连续划线转板3次，挑取菌落大、生长较快的单菌株接入对羟基苯甲酸胁迫培养基斜面，4 ℃保存，备用。

1.3 菌株的鉴定

参照Barnett法[12]对筛选出的菌株的形态特征进行初步鉴定，参照Ebada法[13]对筛选出的菌株的生理生化特性进行鉴定。

1.4 菌株的cDNA文库构建和基因测序

将筛选出的菌株在LB液体培养基中过夜培养至OD600=1；离心，收集菌体，分别重悬于等体积的对羟基苯甲酸胁迫培养基与葡萄糖基础培养基中，25 ℃培养72 h；离心，收集菌体，采用TRIzol法(Invitrogen，美国)提取总RNA[14]。以5 μg总RNA起始量建库，采用TruSeq RNA文库制备试剂盒(Illumina)构建文库，按数据比例混合上机；cBot上进行桥式PCR扩增，生成clusters；在Hiseq 2500测序平台进行2×100 bp测序[15]。

2 结果与讨论

2.1 菌株的形态与生理生化特性

经过分离纯化，得到一株能以对羟基苯甲酸为唯一碳源(200 mg·L-1)生长的菌株。该菌株的菌落特征为：圆形，白色，表面光滑，边缘齐整；生理生化特性为：细胞呈卵圆形，革兰氏染色阳性，有芽孢，出芽生殖。

菌株经过PCR扩增、测序，选择同源性大于97%的基因序列构建系统发育树。结果发现，菌株与克雷白氏杆菌(Klebsiellapneumoniae)的同源性最高，结合菌株形态、菌落特征及生理生化特性，鉴定为克雷白氏杆菌，命名为K.pneumoniaeTzyx1。

2.2 K.pneumoniae Tzyx1降解对羟基苯甲酸的调控基因及降解途径

根据K.pneumoniaeTzyx1 unigenes功能注释分析结果[16]，推测K.pneumoniaeTzyx1对对羟基苯甲酸的降解途径如图1所示，涉及对羟基苯甲酸原儿茶酸代谢途径的调控基因有8个，列于表1。

图1 K.pneumoniae Tzyx1对对羟基苯甲酸的降解途径

表1 K.pneumoniae Tzyx1中涉及对羟基苯甲酸原儿茶酸代谢途径的调控基因

根据注释结果，K.pneumoniaeTzyx1至少存在1种完整的KEGG pathway记录的苯环开环方式，是在单加氧酶(p-hydroxybenzoate 3-monooxygenase)的作用下在对羟基苯甲酸的3位引入一个羟基将其转化生成原儿茶酸，原儿茶酸拥有邻二醇结构，可以被双加氧酶开环。之后，在原儿茶酸3,4-双加氧酶(protocate-chuate 3,4-dioxygenase)的作用下内开环生成3-羧基粘康酸。这些开环产物在一系列水解酶、水合酶和醛缩酶的作用下，经过反应代谢为乙酰辅酶A和琥珀酰辅酶A，进入柠檬酸循环(图1)。

2.3 K.pneumoniae Tzyx1降解对羟基苯甲酸的其它基因(表2)

表2 K.pneumoniae Tzyx1降解对羟基苯甲酸的其它基因

表2列出了K.pneumoniaeTzyx1中可能参与苯环开环后的降解、但不参与上述代谢途径的其它基因。如脱羧酶(4-carboxymuconolactone decarboxylase)，其催化对羟基苯甲酸的脱羧反应生成苯酚[17]，苯酚在苯酚单加氧酶的催化下转化成邻苯二酚；又如CoA连接酶，其可以催化对羟基苯甲酸转化成4-羟基苯甲酰-CoA。由此推断K.pneumoniaeTzyx1可能存在其它未报道的参与苯环开环的基因，也有可能存在其它未报道的苯环开环方式。

3 结论

K.pneumoniaeTzyx1涉及对羟基苯甲酸原儿茶酸代谢途径的调控基因有8个，存在至少一种完整的KEGG pathway记录的苯环开环方式，原儿茶酸代谢途径的起始化合物为有取代基团的芳烃类化合物。同时，K.pneumoniaeTzyx1可以降解无取代基团的芳烃类化合物，且存在一些参与其它苯环开环降解途径的下游基因。因此，K.pneumoniaeTzyx1可能存在其它芳烃化合物的降解途径，如脱碳酸途径和苯甲酰-CoA还原途径。