反向-HPLC法同时检测复方益肝丸3种活性成分的含量

李业雨,刘世萍,马妍妍,海 鑫

0 引言

复方益肝丸是由茵陈、龙胆、牡丹皮、丹参、大黄、红花等28味药材提取加工而成的一种中药成方制剂[1-4]，具有清热利湿、疏肝理脾、化瘀散结等功效，临床上常用于湿热毒所致的胁肋胀痛、黄疸、口干口苦、苔黄脉弦等，尤其对急、慢性肝炎有较好的治疗效果；因其不良反应较小，在临床上应用较为广泛[5-14]。

《中国药典》2015年版一部，通过检测丹皮酚含量来控制复方益肝丸产品质量[15]，仅监测了牡丹皮药材。为更好地控制复方益肝丸产品的质量，本试验建立高效液相色谱法同时检测复方益肝丸中大黄酸、大黄素和丹皮酚3种成分含量的方法，现报道如下。

1 仪器与试药

Waters 600高效液相色谱仪(美国沃特世公司，配备Waters 2996检测器，Waters 717plus自动进样器，empower色谱工作站)；Agilent ZORBAX SB-C18液相色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)(美国安捷伦科技有限公司)；梅特勒AB135-S微量电子天平(瑞士梅特勒科技有限公司)；Milli-Q A10纯化水处理器(美国密理博科技有限公司)；KQ-2400数控超声仪(昆山超声波仪器有限公司)。

大黄酸对照品(含量99.3%，批号：110757-201607)、大黄素对照品(含量98.7%，批号：110756-201512)、丹皮酚对照品(含量99.9%，批号：110708-201407)均购自中国食品药品检定研究院；甲醇、乙腈均为HPLC级；磷酸为优级纯；纯化水为自制。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流速：1.0 ml/min；柱温：30 ℃；进样量：20 μl；检测波长：261 nm；扫描波长：190～400 nm；流动相：0.1%磷酸水溶液(A)、乙腈(B)，梯度洗脱；洗脱程序见表1。

表1 洗脱程序

2.2 溶液配制 混合对照品储备溶液：分别取大黄酸、大黄素和丹皮酚对照品各25.0 mg，精密称定，置于25 ml容量瓶中，加甲醇18 ml，超声溶解，加甲醇定容至刻度，摇匀；制成浓度分别为1.0 mg/ml的混合对照品储备溶液，2～8 ℃条件储存。

对照品溶液：取混合对照品储备溶液适量，制成质量浓度均为6.0 μg/ml的对照品溶液。加甲醇定容至刻度，摇匀。

供试品溶液：取复方益肝丸供试品适量，研成细粉，取约0.5 g，精密称定，置25 ml量瓶中，加甲醇约20 ml，超声提取约20 min(功率300 W，频率55 kHz)；取出放冷，加甲醇至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。

阴性供试品溶液：按复方益肝丸制备方法和药材配比比例，制备缺牡丹皮和大黄的阴性样品，按供试品溶液制备方法制备阴性对照溶液。

2.3 专属性试验 分别取“2.2”项下对照品溶液、阴性供试品溶液、供试品溶液和空白溶液，按“2.1”项下方法分别进样分析，记录色谱图。结果阴性供试品溶液色谱图中，在所测定的丹皮酚、大黄酸和大黄素3种活性成分对应的位置无干扰，3种活性成分分离度等符合药典要求。典型谱图见图1。

图1 HPLC图

2.4 线性关系考察 分别精密量取混合对照品储备溶液适量，制成浓度分别为0.3、0.6、1.0、6.0、15.0、30.0 μg/ml的混合标准溶液，加甲醇至刻度，摇匀；取上述溶液注入液相色谱仪，记录色谱图。以浓度为横坐标(x)、峰面积为纵坐标(y)进行线性回归，计算各成分线性范围和相关系数；取对照品溶液，逐级稀释，以3倍信噪比计算检出限。结果见表2。

表2 回归方程、相关系数及检出限

2.5 重复性与精密度试验 取复方益肝丸样品(批号：180413)，按“2.2”项下供试品溶液配制方法处理样品，平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件设置仪器，待仪器稳定后，6份供试品溶液分别进样20 μl，计算相对标准偏差。结果测得丹皮酚、大黄酸和大黄素峰面积RSD分别为2.11%、3.08%和2.16%，表明方法重复性良好；取“2.2”项下对照品溶液，连续进样6次，计算相对标准偏差。结果测得丹皮酚、大黄酸和大黄素峰面积RSD分别为1.08%、1.52%和0.65%，表明方法精密度良好。

2.6 稳定性试验 取复方益肝丸样品(批号：180413)，按“2.2”项下供试品溶液配制方法处理样品，按“2.1”项下色谱条件设置仪器，待仪器稳定后，分别于0、3、6、9、12、24 h，进样20 μl，记录色谱图，计算相对标准偏差。

结果显示，丹皮酚、大黄酸和大黄素峰面积RSD分别为1.25%、1.44%和0.89%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 加标回收率试验 取复方益肝丸样品(批号：180413)，研成细粉，取约0.5 g，精密称定，置25 ml量瓶中，精密加入“2.2”项下混合对照品储备溶液适量，后续按“2.2”项下供试品溶液配制方法处理样品，按“2.1”项下色谱条件设置仪器，待仪器稳定后，分别进样分析，计算各成分加标回收率。结果见表3。

表3 回收率试验

2.8 样品测定 取市售复方益肝丸样品(批号:180413、180522、181217)，按“2.2”项下供试品溶液配制方法处理样品，按“2.1”项下色谱条件设置仪器，待仪器稳定后，分别进样分析，外标法计算丹皮酚、大黄酸和大黄素峰含量。结果见表4。

表4 样品中3种待测物含量(mg/g)

3 讨论

3.1 波长的选择 取丹皮酚对照品约10.0 mg，精密称定，置200 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密吸取上述溶液1.0 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，丹皮酚测试溶液浓度为5.0 μg/ml。同法配制大黄酸和大黄素测试溶液。取上述测试溶液，分别在紫外可见光谱进行波谱扫描(扫描范围190～450 nm)。结果为在261 nm处，丹皮酚、大黄酸和大黄素吸收强度较强，因此选择261 nm作为检测波长。

3.2 流动相的选择 试验考察甲醇-0.1%磷酸水溶液和乙腈-0.1%磷酸水溶液2种流动相组合体系。结果在甲醇-0.1%磷酸水溶液体系下，大黄酸和大黄素分离效果较差，且分析时间长，检测效率偏低；在乙腈-0.1%磷酸水溶液体系下，丹皮酚、大黄酸和大黄素色谱峰分离效果较好，峰型好，符合系统适应性要求，因此，本试验选择乙腈-0.1%磷酸水溶液体系作为流动相体系。

本试验建立了高效液相色谱检测复方益肝丸中活性成分丹皮酚、大黄酸和大黄素含量的分析方法，考察了分析方法的线性、重复性、精密度、加标回收率等，优化了试验波长和流动相，结果证明，该方法具有简单、快速、准确等优点，可以用于复方益肝丸产品的质量控制。