活血清解汤对急性胰腺炎大鼠的调节作用及相关机制研究

汪 扬，陈 诚，梁 超，彭品伟，陈 腾

0 引言

急性胰腺炎(Acute pancreatitis，AP)是一种发生于胰腺内的急性炎症，可导致邻近器官或其他器官系统的衰竭，其发病率高，严重危害人们的健康和生活。胆结石和酒精是AP发生的主要原因。已有研究证明，活血清解汤能够通过上调瘦素及瘦素受体的表达，调节细胞因子网络平衡，阻断炎症介质的级联效应，从而阻止高脂血症性胰腺炎的发生和发展[1]。本研究采用L-精氨酸腹腔注射诱导急性结肠炎大鼠，探讨中药活血清解汤对AP的作用效果，及其对相关基因的调控作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级别雄性SD大鼠(200±20) g，购自上海杰思捷实验动物有限公司。在温度(26±2)℃，相对湿度50%条件下适应1周，自由饮用洁净自来水(符合上海市饮用水标准)，饲喂普通的维持饲料，垫料用辐照后的玉米芯。

1.2 活血清解汤的制备 采用生大黄15 g，蜜麸炒枳实12 g，芒硝6 g，柴胡12 g，光桃仁12 g，黄连9 g，黄芩9 g，生丹参15 g、赤芍9 g，共99 g，加水熬制，最后制成10袋活血清解汤，每袋160 ml。

1.3 其他试剂 L-精氨酸：购自上海源叶生物科技有限公司。苏木精染液和伊红染液：购自珠海贝索生物技术有限公司。RNA逆转录试剂盒(PrimeScriptTMRT Master Mix)和RNAiso Plus(Trizol)购自TaKaRa。HO-1一抗和GAPDH抗体购自Proteintech公司；Anti-IL-1β一抗购自Abcam。BCA蛋白测定试剂盒购自于Thermo公司。大鼠IL-6 ELISA试剂盒和大鼠IL-1β ELISA试剂盒购自ABclonal公司。

1.4 AP动物模型的制备及分组 参照Tani等[2]和刘大晟等[3]的造模方法，制备大鼠AP模型。实验前大鼠禁食12 h，自由饮水。大鼠消毒后，采用配制好的20%L-精氨酸溶液腹腔注射大鼠，剂量为 2.5 g/kg体重，间隔1 h注射1次，共注射2次，构建AP模型。注射药物24 h后，对大鼠进行病理检查，证实胰腺组织间质充血、水肿明显，并有中性粒细胞、单核细胞等炎性细胞的浸润，伴有淡血性腹水即提示造模成功。

健康SD大鼠被随机分成3组，每组6只。①空白对照组(C组)：以相同方式腹腔注射等体积的生理盐水，之后灌胃等剂量的生理盐水。②模型组(M组)：腹腔注射L-精氨酸，造模成功后，大鼠灌胃等剂量的生理盐水。③治疗组(T组)：腹腔注射L-精氨酸，造模成功后，大鼠灌胃活血清解汤，每次20 ml/kg，每6 h灌胃1次。

1.5 标本采集 于给药后24 h和36 h，各组大鼠采用2.5%戊巴比妥钠腹腔注射，麻醉大鼠，抽取大鼠的主动脉血，室温静置0.5 h，1 900 g离心10 min，分离得到血清，保存于-80 ℃。同时，收集各组大鼠的胰腺组织，用无菌PBS清洗组织，一部分用4%多聚甲醛固定，另一部分冻存于-80 ℃，用于后续分析。

1.6 观察指标

1.6.1 病理形态观察 将固定24 h的胰腺组织取出，蒸馏水冲洗30 min，去除多余固定液后，进行石蜡包埋、切片，以及苏木精-伊红染色，在光学显微镜下观察胰腺组织的病理学改变。

1.6.2 荧光定量PCR(RT-PCR)检测大鼠胰腺组织中相关基因的表达 根据Liu等[4]的方法进行RT-PCR。首先提取胰腺组织中的RNA。取50 mg胰腺组织加入1 ml Trizol。用组织匀浆器匀浆后，加入200 μl氯仿，震荡均匀后室温放置2 min，4 ℃、12 000 g离心15 min，取上层水相于另一离心管中。然后加入0.5 ml异丙醇，混匀，4 ℃、12 000 g离心10 min，弃上清。向沉淀中加入1 ml 75%乙醇溶液，温和颠倒离心管，4 ℃、7 500 g离心5 min，弃上清，室温晾干10 min，用20 μl DEPC H2O溶解沉淀，得到RNA。得到的RNA溶液于分光光度计上检测RNA的纯度和浓度。

根据RNA逆转录试剂盒的说明书，对提取的RNA进行反转录，合成cDNA。反转录后进行荧光定量PCR扩增，其引物序列如表1所示，反应条件为50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环，72 ℃延伸7 min，最后降至4 ℃ 结束反应。其中，GAPDH作为内参。

表1 各基因的引物及引物序列

1.6.3 免疫组化检测HO-1和IL-1β的表达 过氧化物酶标记的二步法检测胰腺组织中HO-1和IL-1β的表达。一抗为HO-1(1∶200)和IL-1β(1∶400)，二抗为辣根酶标记的羊抗兔IgG(1∶500)。用DAB显色液染色1 min，自来水冲洗终止反应后，在光学显微镜下观察。

1.6.4 Western blot检测HO-1蛋白和IL-1β蛋白的表达 胰腺组织置于蛋白裂解液中，制备组织匀浆，提取胰腺组织中总蛋白质。根据BCA蛋白测定试剂盒的制造商说明书，测定所提取样品的蛋白质浓度。取20 μg蛋白进行10% SDS-PAGE电泳，转膜，5%脱脂牛奶37 ℃封闭1 h后，加入一抗HO-1(1∶1 000)、IL-1β(1∶1 000)和GAPDH(1∶2 000)4 ℃孵育过夜。洗膜后，加二抗(抗兔，1∶5 000)，37 ℃孵育2 h。洗膜后，加入ECL试剂，压片后，拍照保存。

1.6.5 ELISA检测血清中IL-1β和IL-6的水平 按照检测试剂盒说明书，对大鼠炎症因子IL-1β和IL-6水平进行测定。

2 结果

2.1 胰腺组织的病理形态 由图1可见，空白对照组的胰腺组织结构完整，无细胞水肿，胰管走行正常，未见小叶间间隙增宽，无出血坏死和炎性细胞的浸润。而模型组在造模24 h后，可见胰腺结构紊乱，弥漫性小叶间水肿，间质充血水肿，并伴有炎性细胞的浸润。然而，在造模36 h后，胰腺组织的损伤进一步加重，有更多的炎性细胞浸润，腺泡结构破坏伴有血管损伤，腺周围组织出血坏死。

图1 不同组别大鼠胰腺组织的HE染色结果

用活血清解汤对造模成功的大鼠治疗24 h后，胰腺组织充血水肿较模型组有所减轻，并且炎性细胞浸润减少。治疗36 h后，胰腺组织坏死较少，腺泡结构破坏及血管损伤不明显，其胰腺炎症得到一定的改善。

2.2 RT-PCR结果 在模型组中，HO-1的表达高于对照组(P<0.05)；灌胃活血清解汤后，其表达水平增加(P<0.05)，说明活血清解汤可能通过促进HO-1的表达缓解AP。模型组大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA表达水平升高(P<0.05)，活血清解汤给药处理后，其mRNA表达水平均下降，IL-1β、TNF-α表达水平与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见图2。

GSTM3在空白对照组和模型组中的相对表达量为27.42±1.51和2.98±2.80，而在治疗组中为26.66±5.21，说明在急性胰腺炎大鼠中GSTM3的mRNA表达水平显著增加(P<0.05)。活血清解汤处理后，其表达水平下降，与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。RyR的mRNA相对表达量在模型组中为0.07±0.01，而在治疗组中，其相对表达量为6.74±0.52，说明活血清解汤可以促进RyR基因的表达，见图2。

2.3 HO-1、IL-1β免疫组化和Western blot检测结果 模型组胰腺组织中HO-1、IL-1β表达水平高于空白对照组，治疗组HO-1表达水平高于空白对照组，而IL-1β表达低于模型组，见图3。HO-1、IL-1β的Western blot蛋白检测结果如图4所示。结果显示，模型组胰腺组织中HO-1、IL-1β的蛋白表达高于空白对照组，治疗组HO-1蛋白表达高于模型组，IL-1β蛋白表达水平低于模型组。

2.4 ELISA检测血清中IL-1β、IL-6表达 结果可知，与对照组相比，模型组中IL-1β[(104.67±22.48) pg/ml]、IL-6[(223.33±64.65) pg/ml]的含量明显增加，治疗组大鼠血清中IL-1β、IL-6含量分别下降至(90.92±23.83)、(190±72.01)pg/ml。见图5。

图2 HO-1、IL-1β、IL-6、TNF-α、GSTM3和RyR基因mRNA水平相对表达量

图3 HO-1、IL-1β的免疫组化结果

图4 HO-1、IL-1β的Western blot蛋白检测结果

图5 ELISA检测血清中IL-1β和 IL-6的表达

3 讨论

AP是一种常见的急性腹部疾病，在早期易导致系统性炎症反应综合征(Systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，最终导致多器官功能障碍，死亡率高达15%～20%[5]。在AP炎症反应期间，常见的信号转导途径主要是促进促炎因子的产生，诱导氧化应激反应，激活 MAPK和NF-κB信号传导途径，从而导致炎症级联反应放大[6-7]。有许多研究表明，氧化应激和炎症反应的改善是缓解AP的主要机制[8-10]。

近年来，多种应激源如缺氧、高热、创伤等都能诱导HO-1表达，这是机体在应激状态下的一种适应性保护反应[8]。HO-1是一种普遍表达的可诱导酶，可将血红蛋白降解为一氧化碳、联肝素和Fe2+，参与维持细胞内稳态，并通过减少氧化损伤，抑制细胞凋亡和减弱炎症反应，在保护细胞组织中发挥重要作用[11]。越来越多的证据表明，HO-1的过表达可应用于多种临床情况，例如器官移植，急性肾损伤，高血压和动脉粥样硬化[12-14]。本研究用活血清解汤治疗AP大鼠，结果发现，活血清解汤治疗后，胰腺组织损伤较模型组显著减轻。为了进一步探讨其机制，本研究用qPCR、免疫组化和Western blot的方法，检测HO-1在不同组别中的表达情况。结果发现，在模型组中，HO-1的表达水平较空白对照组增强，但是用活血清解汤处理后，HO-1的表达水平进一步增加，说明活血清解汤可以通过上调HO-1的表达来保护胰腺组织，从而缓解急性胰腺炎。

此外，炎症反应贯穿于AP发病的全过程，并且体循环中促炎细胞因子的水平与AP的严重程度呈正相关[15]。IL-1β和IL-6是参与炎症和免疫反应的非常重要的促炎因子；TNF-α是一种多效细胞因子，对急性和慢性胰腺炎的发展具有非常重要的作用[16-18]。Coelho等[19]研究表明，己酮可可碱可以通过降低促炎因子的水平(IL-6、TNF-α)和增强抗炎因子(IL-10)的表达来缓解AP。本研究检测了IL-1β、IL-6、TNF-α mRNA及IL-1β蛋白，血清中IL-1β和IL-6的表达情况，结果均显示，不管是在胰腺组织还是体内，这3种促炎因子的水平在模型组中均显著增强，而经过活血清解汤治疗后，其水平均有所下降，表明在AP大鼠中，促炎因子显著表达，而活血清解汤可以通过调节促炎因子的水平改善炎症反应，缓解AP。

GSTM3是GSTs超家族一种重要的同工酶。赵明理等[20]通过检测GSTM3在重症肌无力患者胸腺组织中的表达，发现在肌无力患者中，GSTM3的mRNA表达水平显著增加。在本研究中，在模型组中GSTM3 mRNA表达高于与对照组，而用活血清解汤治疗胰腺炎大鼠后，其表达水平有所下降，与对照组比较差异无统计学意义。RyR是另外一种与氧化应激反应通路有关的基因，本研究结果显示，在模型组中RyR基因的表达水平显著下降，而用活血清解汤治疗后，其mRNA表达显著增强，提示活血清解汤可以用过增加RyR基因表达来缓解氧化应激反应，从而改善AP。

综上，活血清解汤可以通过上调HO-1的表达，降低体内促炎因子的含量来抑制炎症反应，以及上调RyR基因来调节氧化应激反应，从而实现对胰腺的保护作用，缓解急性胰腺炎。