夜香树花提取物对宫颈癌细胞增殖及凋亡的影响

卢红梅，覃清霞，戴传勇，李泰球，何欢

（广西农业职业技术学院，广西 南宁）

0 引言

夜香树（Cestrum nocturnum Linn，简写为CN），又名夜来香，为茄科夜香树属植物，广泛种植于热带、亚热带地区，药物资源丰富。流行病学研究调查显示，宫颈癌是妇女最常见的生殖系统恶性肿瘤[1]，给患者的身心健康带来严重影响。本研究拟探讨夜香树花提取物在体外对Hela细胞增殖的抑制作用，在此基础上进一步探讨其对Hela细胞周期和细胞凋亡的影响。

1 实验材料

1.1 细胞株

Hela细胞从上海细胞生物研究所细胞库购买。

1.2 仪器

CO2培养箱（美国产，型号381）； 倒置显微镜（日本产，型号CK40）；倒置荧光显微镜（日本产，型号TE2000-U）；酶标仪（奥地利产，型号Sunrise）；96孔板（德国产，型号3679）；稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂，型号DYY-6B）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂，型号RE-52AA）；流式细胞仪（美国产，型号Epricsxl）。

1.3 受试药品与试剂

夜香树花提取物；MTT（德国Sigma公司产）；PBS（杭州四季青生物工程材料有限公司产）；Trypsin（天津市景洋生物制品有限责任公司产）；DMSO（上海润捷化学试剂有限公司产）； RNase酶（sigma分装）；碘化丙啶（PI，sigma分装）；RPMI-1640培养基（美国GIBCO公司产）。

2 实验方法

2.1 受试药品的制备和配制

夜香树花（CN花）晒干，用95%乙醇浸泡3天，水浴回流提取2次，滤液进行常压蒸馏，浓缩得浸膏。浸膏用RPMI-1640培养基溶解，配成五个不同的浓度，分别是5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL；空白对照为等体积的RPMI-1640培养基。

2.2 体外MTT法及细胞生长观察 [2,3]

Hela细胞用0.5ml 、0.25%的胰蛋白酶消化，用含10%牛血清的RPMI-1640培养液调配成浓度为5×103个/ mL，接种于96孔板，给药组为190 μL细胞悬浮液和10μL药液，即200μL/孔，空白组为190 μL细胞悬浮液和10μL生理盐水，受试药品每种浓度设3个平行孔，37℃、10% CO2培养3d。3d天后，用倒置显微镜（10×10）观察细胞的生长情况及形态学变化。后弃上清液，每孔加入0.2mg/mL、200μL MTT溶液，震荡均匀后继续培养4h。再弃上清液，加入200μL DMSO溶液/孔，振荡和溶解MTT甲臜沉淀，用酶标仪（波长为550nm、参比波长为450nm）测定其OD值。抑瘤率%=（1-实验组平均OD值/对照组平均OD值）×100%。

2.3 体外诱导Hela细胞凋亡的实验研究

2.3.1 流式细胞术法检测Hela的细胞周期及凋亡情况[4,5]

Hela细胞用含10%牛血清的RPMI-1640培养液配成1.5×105个/mL的细胞悬液，培养在放有载玻片的培养瓶中，每瓶6mL，并加入浓度为20ug/mL的受试药液。空白对照组为等体积的RPMI-1640培养液，37℃、10% CO2培养3d，收集培养瓶中的Hela细胞，用PBS洗涤2次，4℃、70%乙醇固定。第2d，离心（1500r/min、4℃）除去固定液，加0.5ml PBS重悬细胞，加（6μl、10mg/mL）RNase酶/管，37℃水浴20min，200目筛过滤除去粘连细胞，加50μg/ml PI染液，室温染色30min，上机。流式细胞仪测定细胞周期各时期细胞的比例和细胞凋亡。

2.3.2 形态学观察：瑞氏-吉姆萨染色法[4]

步骤2.3.1中，Hela细胞培养3d后，取出载玻片用甲醇固定10min，先用瑞氏染液染色5min，再用吉姆萨溶液与Sorensen磷酸缓冲液以1:9配成混合液（现配现用），染色10min。用水冲洗，晾干，镜检（10×40）。

2.4 统计学处理

3 实验结果

3.1 体外对Hela细胞增殖的影响

CN花提取物对人宫颈癌细胞Hela的增殖抑制作用明显，且与剂量相关，五个剂量组对细胞的增殖抑制率分别为8.96% 、16.32% 、41.07% 、68. 74% 、70. 11%，说明在一定浓度内，药物剂量对Hela细胞增殖抑制作用成正相关。见表1。

3.2 Hela细胞的生长情况及形态学变化

①空白组：细胞成集落、个体较大、饱满、折光性好、形态均一、呈多边形；②5μg/mL CN花提取物组：细胞集落渐变小、折光性减弱、形态稍变圆形；③10μg/mL CN花提取物组：细胞集落渐变小、折光性减弱、形态稍变圆形；④20μg/mL CN花提取物组：细胞集落变小、散在、大小不一、折光性弱、变圆形；⑤40μg/mL CN花提取物组：细胞散在、部分胞体变小皱缩、且轮廓消失；⑥80μg/mL CN花提取物组：胞体皱缩、坏死。见图1。

表1 CN花提取物对宫颈癌细胞Hela增殖的抑制作用（±s，n=3）

表1 CN花提取物对宫颈癌细胞Hela增殖的抑制作用（±s，n=3）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

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图1 受试药物作用于Hela细胞3d后细胞的形态学变化及生长情况

3.3 体外诱导Hela细胞凋亡的研究

3.3.1 诱导Hela细胞凋亡的形态学变化

①空白对照组：细胞膜完整、胞质透明、核大且圆；②20ug/mL CN花提取物组：

细胞变小变圆、细胞膜不够完整，核质较皱缩。见图2。

3.3.2 流式细胞术法检测Hela细胞周期变化

流式细胞术法检测结果可知，CN花提取物（20ug/mL）在体外对Hela细胞的细胞周期有较明显作用，G0/G1期细胞从46.8%下降到32.4%，S期细胞从38.7%上升到51.1%，G2/M期细胞变化不明显，其凋亡率为31.2%，较高，与空白组比较有显著性差异。见表2。

4 讨论

宫颈癌是目前临床严重影响妇女健康的最常见恶性肿瘤之一，调查研究显示，我国每年有大约20万妇女死于宫颈癌，其发生率仅次于乳腺癌，位居妇女肿瘤疾患的第2位，且有年轻化的趋势[6,7]。由于宫颈癌恶性程度高，对患者危害巨大，因此探索宫颈癌的防治方案成为当前医学研究的重要课题。

表2 流式细胞术法检测CN花提取物对Hela的调亡率和细胞周期

体外筛选抗肿瘤药物具有用药少、周期短、费用少等优势，且其筛选结果与体内实验的相关性好，因此已被一些研究机构作为常规的抗肿瘤药物初筛手段[8]。本实验通过MTT法证实CN花提取物在体外对人宫颈癌细胞Hela增殖的抑制作用明显，且抑制作用与剂量相关。

图2 Hela细胞瑞氏-吉姆萨染色后的形态学变化

诱导细胞凋亡是药物抗肿瘤研究的一个重要领域，而观察肿瘤细胞的形态学变化是测定细胞凋亡的一种途径。本实验通过瑞氏-吉姆萨染色法对Hela细胞进行形态学观察，观察到CN花提取物（20μg/mL）与空白组比较，细胞变小变圆，细胞膜不够完整，核质较皱缩。流式细胞术法检测结果进一步表明，CN花提取物（20ug/mL）在体外对Hela细胞的细胞周期有较明显作用，其凋亡率为31.2%，较高，可能是通过阻断细胞由S期进入G2/M期而诱导细胞凋亡。本实验为夜香树花今后的进一步研究和开发提供理论依据。