香荚兰豆中香兰素葡萄糖苷的提取、分离及表征

杨 峰，黄 申，席高磊，陈芝飞，于国强，付瑜锋，蔡莉莉，樊新顺，赵志伟，李 杰，王小飞，王 东*

1. 河南卷烟工业烟草薄片有限公司，河南省许昌市金叶大道666 号 461000

2. 郑州轻工业大学食品与生物工程学院，郑州高新技术产业开发区科学大道136 号 450002

3. 河南中烟工业有限责任公司技术中心，郑州市经开区第三大街8 号 450016

香兰素又名香草醛（3-甲氧基-4-羟基苯甲醛），是一种具有香荚兰香气及浓郁奶香的重要香料，广泛应用于烟草、食品、日化、医药等工业领域［1-2］。化学合成香兰素具有原料来源稳定、生产技术成熟、产品价格较低等优点，但同时亦存在产品香气单一、风味易受杂质影响等问题［3-4］。当前，烟草行业使用的香兰素大多为化学合成香兰素，与天然香兰素相比，其在烟草及烟草制品中应用时缺乏天然、丰富的香气韵调。同时，随着人们对食品安全问题的日益关注，天然香兰素备受青睐，但其供给量不到香兰素全球需求量的1%［5-6］。

天然香兰素主要存在于香荚兰等天然植物中，其在成熟香荚兰豆中的质量分数达1.5%～3.0%［7-8］。在杀青、发酵、催熟和干燥等工艺处理前，成熟香荚兰豆中的香兰素主要以香兰素葡萄糖苷的形式存在，随后其在β-葡萄糖苷水解酶催化作用下水解生成香兰素［9-12］。近年来，从香荚兰豆中提取香兰素葡萄糖苷，再利用外加β-葡萄糖苷酶进行水解，已成为获取高品质天然香兰素的重要途径。迄今为止，利用β-葡萄糖苷水解酶催化香兰素葡萄糖苷、获得天然香兰素的研究已较为深入［9-15］，但香兰素葡萄糖苷提取相关技术研究鲜有报道。

本研究中，以香荚兰豆为原料，通过超声辅助萃取获得香兰素葡萄糖苷粗提物，并以超高压高效液相色谱（UPLC）技术为检测手段，以香兰素葡萄糖苷提取率为指标，进行提取工艺条件优化，再利用制备高效液相色谱技术分离得到高品质香兰素葡萄糖苷，旨在建立香荚兰豆中香兰素葡萄糖苷的简单制备方法，为提高天然香兰素资源开发利用效率提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

新鲜成熟香荚兰豆购于海南热带植物园，置于-80℃冰箱中保存。

无水乙醇（AR，天津富宇精细化工有限公司）；甲醇（色谱纯，迈瑞达科技有限公司）；乙酸（AR，济宁市中凯新型材料有限公司）；香兰素葡萄糖苷（色谱纯，北京凯森来医药科技有限公司）。

RE52-99 旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；WD-9415C 超声波清洗仪（北京六一仪器厂）；SHB-IIIA 循环水式多用真空泵（上海豫康科教仪器设备有限公司）；2545 高效制备液相色谱仪（美国Waters 公司）；Acquity I-Class 超高效液相色谱仪（UPLC，美国Waters 公司）；Avance AMX-400 核磁共振仪（德国Bruker 公司）；FD5-3B 真空冷冻干燥器（美国GOLD-SIM 公司）；GM-0.33A 隔膜真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 香兰素葡萄糖苷粗提物制备

选取新鲜成熟的香荚兰豆，于低温冷冻干燥机中干燥12 h 后粉碎；称取100 g 香荚兰豆粉末，置于2 000 mL 烧杯中；加入1 000 mL 无水乙醇，充分搅拌后进行超声萃取，设置超声功率100 W，50℃条件下萃取10 min；萃取后过滤，重复进行3次萃取，合并滤液；减压浓缩，即得到香兰素葡萄糖苷粗提物。

1.2.2 粗提物中香兰素葡萄糖苷含量测定

1.2.2.1 标准溶液配制

标准储备液：准确称取100.0 mg 香兰素葡萄糖苷于小烧杯中，加入无水乙醇溶解后于10 mL 容量瓶中定容，配制成质量浓度为10 mg/mL 乙醇溶液。

标准工作溶液：分别移取0.1、0.2、0.4、0.6 和0.8 mL 标准储备液于5 只2 mL 容量瓶中，用无水乙醇定容，得到5 种质量浓度的工作标准溶液。

1.2.2.2 UPLC 检测

称取10.0 mg（精确至0.1 mg）香兰素葡萄糖苷粗提物于小烧杯中，用少量无水乙醇溶解后转移至2 mL 容量瓶中定容；取样并用0.22 μm 有机滤膜过滤，对滤液进行UPLC 分析。UPLC 分析条件为：

色谱柱：Sunfire C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）；流动相：0.5%乙酸水溶液（A）∶甲醇（B）=80∶20（体积比，下同）；流速：0.2 mL/min；紫外检测器（UV）检测波长：254 nm；进样量：5 μL；柱温：25 ℃。

1.2.3 香兰素葡萄糖苷粗提物制备工艺优化

按照1.2.1 节方法，选取萃取时间A（5、10、15、20 和25 min）、萃取温度B（40、50、60、70 和80 ℃）、固液比C（香荚兰豆粉与乙醇的质量比，1∶5、1∶7、1∶10、1∶12 和1∶15）和萃取功率D（80、100、120、140 和160 W）四个因素，以香兰素葡萄糖苷提取率为指标进行单因素试验，在此基础上进行正交试验，进一步考察不同提取因素对香兰素葡萄糖苷提取率的影响，确定最佳工艺条件。

1.2.4 香兰素葡萄糖苷高压液相分离纯化

设置初始流动相条件和参数，取50 mg 香兰素葡萄糖苷粗品上样进行预实验；根据预实验结果调整流动相梯度、流速等重要参数，逐步增加上样量至最大可处理量；经过多次条件考察，确定最佳参数为上样量200 mg、流速4 mL/min。

采用最佳参数条件，取200 mg 香兰素葡萄糖苷粗品并用6 mL 无水乙醇溶解，上样分离纯化。以0.5%乙酸水溶液和甲醇分别为流动相A 和B，检测波长245 nm，设定阈值350 mAU，使用自动收集器和多管收集方式进行洗脱液的收集。液相色谱条件为：

色谱柱：XBridge@Prep C18OBD 柱（19 mm×150 mm，5 μm）；流动相：0.5%乙酸水溶液（A）和甲醇（B），二者体积比80∶20；流速：4 mL/min；紫外检测器（UV）检测波长：254 nm；进样量：2 mL；柱温：25℃。

2 结果与讨论

2.1 香兰素葡萄糖苷粗提物提取率

按照1.2.1 节方法制备香兰素葡萄糖苷粗提物，得到香兰素葡萄糖苷粗提物2.25 g，采用UPLC 测定，则香兰素葡萄糖苷粗提物中含香兰素葡萄糖苷1.88 g，提取率为1.88%。

2.2 标准工作曲线、精密度和回收率

对1.2.2 节不同质量浓度的标准溶液进行UPLC 分析，以目标物浓度（mg/mL）为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y）进行线性回归，获得标准工作曲线及决定系数；取最低浓度的标准溶液连续测定6 次，计算标准偏差（SD），分别以3 倍和10 倍标准偏差计算方法检出限（LOD）和定量限（LOQ）。结果显示，香兰素葡萄糖苷的标准曲线为y=77 895 x+6 350.9，决定系数R2=0.996 7，LOD 和LOQ 分别为0.30 和1.01 μg。可见，在0～4 mg/mL 范围内标准工作曲线的线性良好，方法的灵敏度较高，适合于目标物定量分析。

采用1.2.1 节方法平行制备5 份香兰素葡萄糖苷粗提物，以相同的色谱条件测定峰面积，按照外标法计算粗提物中香兰素葡萄糖苷量，由此计算相对标准偏差（RSD）。结果显示，RSD 为2.25%，说明方法精密度良好。在已知香兰素葡萄糖苷含量的粗提物样品中，分别在3 个不同水平下进行加标试验，每个水平的样品进行6 次平行测试，并在相同的色谱条件下测定目标物峰面积，以外标法定量并计算回收率。结果显示，3 个加标水平下的平均回收率为92.6%～96.8%，说明方法准确性较高。

2.3 香兰素葡萄糖苷的提取工艺优化

2.3.1 单因素试验

分别以萃取时间、萃取温度、固液比和萃取功率为考察因素，以香兰素葡萄糖苷提取率为考察指标，采用单因素试验研究不同因素对香兰素葡萄糖苷提取效果的影响。

2.3.1.1 萃取时间的影响

固定萃取温度55 ℃、固液比1∶10、萃取功率为100 W，考察不同萃取时间（5、10、15、20 和25 min）对香兰素葡萄糖苷提取率的影响，结果见图1。由图1 可知，随着萃取时间的延长，香兰素葡萄糖苷提取率先升高后趋于稳定，原因是，随着萃取时间的延长，植物细胞中香兰素葡萄糖苷向溶剂中溶解、扩散得越充分，萃取时间超过10 min 后萃取体系达到平衡。因此，选择萃取时间10 min。

图1 萃取时间对香兰素葡萄糖苷提取率的影响Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of vanillin glucoside

2.3.1.2 萃取温度的影响

固定萃取时间10 min、固液比1∶10、萃取功率为100 W，考察不同萃取温度（40、50、60、70 和80 ℃）对香兰素葡萄糖苷提取率的影响，结果见图2。由图2 可知，随着萃取温度的升高，香兰素葡萄糖苷提取率先升高后趋于稳定，在60 ℃时，香兰素提取率最高，原因是，升高温度能够促进分子内能增加，使扩散速率增大，香兰素葡萄糖苷在溶剂中的扩散更快，溶解量也更多，而当温度继续升高时，香兰素葡萄糖苷向溶剂中的扩散接近平衡，其提取率趋于稳定。因此，选择萃取温度60 ℃。

图2 萃取温度对香兰素葡萄糖苷提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of vanillin glucoside

2.3.1.3 固液比的影响

固定萃取温度60℃、萃取时间10 min、萃取功率100 W，考察不同萃取固液比（1∶5、1∶7、1∶10、1∶12 和1∶15）对香兰素葡萄糖苷提取率的影响，结果见图3。由图3 可知，随着萃取溶剂无水乙醇用量的增大，香荚兰豆粉末和溶剂的接触面积增加，香兰素葡萄糖苷更易扩散到溶剂中，因此固液比增大有利于提高香兰素葡萄糖苷的提取率。但当固液比达到1∶10 后，随着萃取溶剂用量的增大，提取率增加不明显。因此，综合成本因素，选择固液比1∶10。

图3 固液比对香兰素葡萄糖苷提取率的影响Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of vanillin glucoside

2.3.1.4 萃取功率的影响

固定萃取温度60 ℃、萃取时间10 min、固液比1∶10，考察不同萃取功率（80、100、120、140 和160 W）对香兰素葡萄糖苷提取率的影响，结果见图4。由图4 可知，香兰素葡萄糖苷的提取率随萃取功率的增加先升高后降低。随着萃取功率的提高，超声波产生的空化作用也越大［16］，香荚兰豆细胞的破碎程度亦随之增大，这会促进香兰素葡萄糖苷的转移、扩散，进而使香兰素葡萄糖苷的提取率增加。当萃取功率达到140 W 时，提取率达到最大，为1.69%，继续增大萃取功率时，提取率不再增加。因此，选择萃取功率140 W。

图4 萃取功率对香兰素葡萄糖苷提取率的影响Fig.4 Effect of extraction power on extraction rate of vanillin glucoside

根据以上单因素试验结果，综合考虑经济成本，初步确定香兰素葡萄糖苷提取的适宜工艺条件为：萃取时间10 min、萃取温度60 ℃、固液比1∶10、萃取功率140 W。

2.3.2 正交试验

根据单因素试验结果，选取萃取时间（A）、萃取温度（B）、固液比（C）、萃取功率（D）四个因素进行三个水平正交试验，并进行极差分析，结果见表1。由表1 可知：A～D 四个因素的极差分别为0.04%、0.15%、0.21%和0.05%，这些因素对提取率的影响顺序为C＞B＞D＞A。因此，可确定最优水平组合为C3B3D2A2，即超声辅助溶剂萃取法提取香荚兰豆中香兰素葡萄糖苷的最佳工艺条件为：固液比1∶11、萃取温度65 ℃、萃取时间10 min、萃取功率140 W，萃取3 次。在此条件下进行重复性验证试验，3 次试验的香兰素葡萄糖苷提取率分别为1.88%、1.90%和1.87%，平均值为1.88%，可见，在此条件下萃取试验的重复性较好，香兰素葡萄糖苷的得率较高。

表1 正交试验结果Tab.1 Result of orthogonal test

2.4 香兰素葡萄糖苷分离纯化条件优化

以乙酸水溶液和甲醇为流动相，利用制备高效液相色谱技术对粗提物中香兰素葡萄糖苷进行分离纯化。通过改变流动相乙酸水溶液和甲醇之间的比例，考察其对香兰素葡萄糖苷分离效果的影响，结果见图5。

从图5 可以看出，当乙酸水溶液和甲醇体积比为50∶50 时，香兰素葡萄糖苷与杂质未达到基线分离，且色谱峰形较差。随着流动相中乙酸水溶液占比的提升，香兰素葡萄糖苷的分离度增大，色谱峰形变好，当流动相中乙酸水溶液和甲醇比例达到80∶20 时，香兰素葡萄糖苷基本上达到基线分离。

图5 流动相对香兰素葡萄糖苷分离效果的影响Fig.5 Effect of flow phase on separation of vanillin glucoside

在最佳参数条件下高压制备液相色谱的分离纯化效果如图5D 所示，在254 nm 收集波长下检测到响应阈值超过350 mAU 后开始自动进行洗脱液收集，最终收集到1 个色谱峰所对应的洗脱液。结果显示，该洗脱液的色谱峰形单一，通过对收集的洗脱液进行浓缩和称量，发现经过纯化后的香兰素葡萄糖苷的提取率为1.36%。

2.5 结构表征

采用1H NMR 和13C NMR 对分离纯化的产品进行结构表征，以确定是否为香兰素葡萄糖苷（图6），结果见表2。从1H NMR 可以看出，低场处δH9.59 为香兰素葡萄糖苷醛基氢，δH7.13、7.33 和7.41三组峰为3 个苯环氢，δH5.12～3.37 五组峰为吡喃葡萄糖单元7 个氢，δH3.77 为甲氧基氢。从13C NMR 可 以 看 出，低 场 处δC195.1 为 醛 基 碳，δC151.5～111.6 为苯环碳，δC99.9～60.8 为葡萄糖单元六个碳，δC56.2 为甲氧基碳。可见，该化合物为目标物香兰素葡萄糖苷。

图6 香兰素葡萄糖苷结构式Fig.6 Structural formula of vanillin glucoside

表2 香兰素葡萄糖苷的NMR 表征结果Tab.2 NMR characterization of vanillin glucoside

3 结论

从香荚兰豆中提取香兰素葡萄糖苷粗提物的超声辅助溶剂萃取法最佳工艺为：萃取时间10 min、萃取温度65 ℃、固液质量比1∶11、萃取功率140 W、萃取3 次，在此条件下，香兰素葡萄糖苷的提取率为1.88%。利用制备高效液相色谱技术对粗提物中香兰素葡萄糖苷进行了分离纯化，当流动相乙酸水溶液（质量分数0.5%）和甲醇为80∶20（体积比）时，粗提物的色谱分离效果较好，香兰素葡萄糖苷得率达到1.36%。采用1H NMR 和13C NMR 对产品进行了结构表征，所得产品即为目标化合物香兰素葡萄糖苷。本研究中建立的香兰素葡萄糖苷提取分离方法处理量较大、步骤简便、成本低廉，可为天然香兰素葡萄糖苷单体开发提供参考。