EPO衍生肽对大鼠缺血再灌注损伤脑微血管内皮细胞的保护作用

肖韩艳 陈光 韩民 王冬梅 徐甜颖 周淑芬

(牡丹江医学院 1附属第二医院，黑龙江 牡丹江 157000；2附属红旗医院；3牡丹江市第二人民医院)

随着中国人口老龄化社会的到来，缺血性脑血管病发病率逐年升高，该病死亡率高、致残率高及复发率高，是目前临床工作的重点难点〔1〕。为了改善预后，现在大多数研究集中在缺血/再灌注(I/R)损伤和缺血半暗带与其之间的联系〔2〕。人脑微血管内皮细胞(BMECs)是脑部微血管的组成单位，在一定程度上直接决定了缺血区血管新生，进而影响脑组织能否恢复和临床预后〔3〕。本实验观察促红细胞生成素(EPO)衍生肽(HBSP)对I/R的BMECs的作用，并探讨其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 清洁级雄性SD大鼠2只，体重80～100 g，2周龄，购自牡丹江医学院实验动物中心。CO2恒温孵箱购自美国Thermo公司，荧光倒置显微镜购自日本Olympus公司。台式离心机购自德国Biofuge公司，AE-100电子分析天平购自瑞士Mettler公司，化学发光酶标仪购自美国Promega公司，Western印迹系统购自美国Bio-Rad公司，凝胶成像系统购自美国UVP公司。DMEM培养基(低糖)、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔免疫球蛋白(Ig)G购自美国Hyclone公司，Ⅱ型胶原酶购自美国Invitrogen公司，HBSP购自上海科肤生物科技有限公司，噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司，放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液购自上海碧云天生物技术研究所，原位细胞凋亡检测(TUNEL)试剂盒购自美国Roche公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司，β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，电化学发光加强试剂盒购自美国Millipore公司。

1.2大鼠BMECs制备 采集2周龄SD大鼠大脑皮质，应用Ⅱ型胶原酶和分散酶+胶原酶连续消化法，筛网过滤法及两次梯度离心法获得脑微血管段后，接种于培养瓶中进行原代培养，进行形态学观察，以Ⅷ因子相关抗原免疫染色法进行鉴定。

1.3构建模拟I/R模型 取生长状态良好的第3代BMECs，冲洗后，更换为缺血液；置于 CO25%、O21%、N294%的缺氧孵箱中模拟缺血。2 h后将培养液更换为正常培养液，置于恒温 37℃、含5% CO2的正常孵箱中继续培养4 h。

1.4分组 随机分为对照组(不加任何干预)；I/R组、I/R+HBSP组(以1.2中方法缺血培养后，再灌注时分别加入2.5、25.0、50.0、100.0 ng/ml的HBSP)。

1.5采用MTT法检测BMECs增殖数目 BMECs接种于96孔板，分组建立模型。每孔加入MTT溶液，每孔加入DMSO室温下摇床低速震荡10～15 min。于波长490 nm处检测各孔的吸光度值(A值)。

1.6TUNEL法检测BMECs的凋亡 细胞爬片的制备，固定，破膜，设立阳性对照组，滴加TUNEL反应液，阴性对照组只加酶浓缩液(viall液)。磷酸盐缓冲液(PBS)液浸洗3次，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)反应液，于倒置荧光显微镜下，拍照后统计细胞总数和凋亡细胞数，每张爬片随机取5个视野，取平均值。计算凋亡率(AI)及凋亡细胞数占总细胞数的百分比。

1.7Western印迹法检测蛋白激酶B(Akt)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR)、核糖体40 S小亚基S6蛋白激酶(p70S6K)的表达及磷酸化(p)水平 BMECs蛋白样品的制备及定量后，选取了浓度为8%和10%的分离胶，将制备好的蛋白样品取出，3 000 r/min离心5 min，上样孔内加入蛋白样品及蛋白Marker。电泳、转膜后抗体杂交后发光检测，放入凝胶成像系统曝光显影，用软件对条带进行灰度分析。

1.8统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1BMECs增殖能力 与对照组相比，I/R组吸光度值明显下降(P<0.05)。不同浓度HBSP组吸光度显著高于I/R组(P<0.05)，显著低于对照组(P<0.05)，其中I/R+25 ng/ml HBSP组增殖能力最强，见表1。

2.2HBSP对I/R诱导的BMECs凋亡的影响 与对照组相比，I/R组BMECs的凋亡率显著增加(P<0.05)。与I/R组相比，不同浓度的HBSP组凋亡率均明显下降(P<0.05)，下降最明显的为I/R+25.0 ng/ml HBSP组。见表1。

表1 各组BMBCs增殖能力和凋亡率的比较

2.3pAkt、pmTOR、pp70S6K蛋白水平 与I/R组相比，I/R+25.0 ng/ml HBSP组pAkt、pmTOR、pp70S6K水平均显著性增高(P<0.05)，见表2，图1。

表2 各组pAkt，pmTOR,pp70S6K蛋白水平比较

1～3：对照组、I/R组、I/R+25.0 ng/ml HBSP组图1 Western印迹法检测Akt、mTOR、p70S6K蛋白及其磷酸化水平

3 讨 论

血管新生是近年来缺血性脑血管病的研究热点及可能的治疗作用点〔4,5〕，血管新生主要是BMECs的形态改变和数量增多，从而促进新生血管增加，使缺血区脑组织再灌注，改善临床症状〔6〕。

血管新生是一个复杂过程，多个细胞及细胞因子通过多个信号转导系统参其中，具体新生过程不完全明确，但这却是一个潜在的治疗方向，是目前的研究热点。其中磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt/mTOR信号通路参与调控了细胞的生长、增殖、凋亡、血管的生成等。以往研究证实PI3K/Akt通路和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK/ERK)通路在EPO保护肠上皮时起作用〔7〕。本实验发现HBSP可通过PI3K/Akt/mTOR信号通路起到保护SI/R损伤后BMECs的作用，使其活性增强，抑制其凋亡。

近年来发现，EPO在人类海马、皮层神经元、杏仁核、丘脑等脑组织广泛分布，可能是神经系统中的一个新的信号转导分子〔8〕，EPO有促红细胞生成、促血栓形成作用，这是目前临床主要应用方向，但在促进血管新生时这些副作用限制了其临床应用。HBSP是一种可以和 EPO 组织受体(EPOR-βcR)特异性结合的线性多肽链，在糖尿病大鼠模型、鼠脑卒中模型、坐骨神经挤压伤动物模型等实验中均发现其具有刺激血管内皮细胞增殖、促进内皮细胞在基质胶表面迁移、形成管样分支和吻合的作用〔9〕，还有抑制颅内炎症反应、保护神经元作用，这些作用与EPO相似，且无不良反应的发生〔10〕。 本实验发现HBSP对I/R的BMECs 有保护作用，为急性缺血性脑卒中患者的治疗提供了新的方向。