PDCD5蛋白基于顺铂为基础的非小细胞肺癌化疗敏感性

李晶 苏帆 林芷伊 费晶 徐丹 巩平

(1石河子大学医学院第一附属医院肿瘤内科，新疆 石河子 832000；2莱西市人民医院)

在世界范围内肺癌生存率仅为15%〔1〕。非小细胞肺癌(NSCLC)作为癌症相关死亡的最常见原因，约占所有肺癌病例的80%〔2〕。顺铂是一种铂合成复合物，被广泛用作NSCLC治疗的一线化疗药物〔3〕。但是，重复化疗使一些肿瘤产生了耐药性，最终导致复发和预后不良，这使得顺铂的临床疗效受到严重限制〔4〕。因此，发现无严重不良反应的新方法改善化疗、减少化疗耐受具有重要意义〔5，6〕。肿瘤的发病机制与细胞凋亡密切相关。从人红系白血病细胞(TF-1)发生凋亡时克隆而来的TF-1 apoptosis-related基因(TFAR)19，在细胞凋亡中起着至关重要的作用。在TFAR19被国际人类基因提名委员会(加入基因库号：AF014955)指定为程序性细胞死亡因子(PDCD)5之前，首先被Liu等〔7〕于1999年在北京大学人类疾病基因组学中心报道。PDCD5在包括肺癌在内的多种人类肿瘤中表达都降低〔8〕。重组人PDCD5 (rhPDCD5)蛋白通过网格蛋白独立的内吞作用进入细胞，促进细胞凋亡活性〔9〕。这说明rhPDCD5不仅使软骨肉瘤〔10〕、肝癌细胞对顺铂化疗敏感〔11〕，而且还使K562细胞对去甲氧柔红霉素(IDR)和阿糖胞苷(Ara-C)化疗敏感。本研究观察rhPDCD5对肺癌细胞对顺铂的化疗敏感性的影响，为提高顺铂的抗肿瘤效果提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料 顺铂购自济南齐鲁药业公司(中国济南)，并根据需要在无菌盐水中制备新鲜稀释液。rhPDCD5蛋白由北京生物海洋技术有限公司(中国北京)提供。PDCD5蛋白的内毒素活性超过10 EU/mg，使用鲎变形细胞裂解液检测，纯度为95%〔12〕。酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自Usen Science Inc.(中国武汉)；人肺腺癌细胞系A549购自中国科学院细胞库(中国上海)。

1.2细胞培养与分组 A549细胞株培养在含10%胎牛血清(BSA)、青链霉素混合液(100×)的RPMI1640培养液中，放置于37℃、5% CO2饱和湿度条件下培养箱中培养。

1.3ELISA检测PDCD5细胞中蛋白水平 细胞在6孔板(每孔4×104个细胞)中生长24 h，然后用顺铂(顺铂组)、顺铂+rhPDCD5 15 μg/ml(rhPOCD5A组)、顺铂+rhPDCD5 30 μg/ml(rhPDCD5 B组)处理，将磷酸盐缓冲液(PBS)用作对照组。处理24 h后，用胰蛋白酶分离贴壁细胞，然后通过离心收集。然后将细胞在冷PBS中洗涤3次。将重悬的PBS(1×)细胞进行超声波处理4次，在4℃下1 500 r/min离心10 min。向每个孔中加入100 μl样品，将细胞在37℃下温育2 h。在抽吸和添加100 μl制备的检测试剂A之前，在37℃下进行第2次温育1 h。然后吸出并洗涤3次。再加入制备的100 μl检测试剂B，在37℃下孵育30 min，然后吸出并洗涤5次。随后加入90 μl底物溶液，在37℃下孵育25 min。最后，添加50 μl终止液并立即用酶标仪读取450 nm波长处OD值。每次处理均重复3次。

1.4MTT比色法检测增殖 采用MTT法测定细胞增殖。细胞生长在96孔板(2×103个细胞)24 h，加药同1.3，加药后12 h、24 h、36 h分别检测细胞增殖抑制率，加入5 mg/ml MTT试剂20 μl，置于暗处培养4 h。酶标仪在490 nm参比(BioRad Lab Technologies，USA)的波长下测量平板的吸光度。结果表示为相对于未处理对照的吸光度百分比，每次处理均重复3次。细胞增殖抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A值)×100%。

1.5流式细胞仪检测细胞凋亡 将A549细胞接种在6孔板(4×105个细胞)中培养24 h。细胞经顺铂和(或)rhPDCD5处理并培养24 h后，用胰蛋白酶分离黏附细胞，离心收集。然后将细胞在冷PBS中洗涤3次，再悬浮在100 ml的结合缓冲液中。根据说明书(中国杭州联科生物)添加FITC耦联的AnnexinV和碘化丙啶(PI)。暗处室温下处理20 min，加入400 ml结合缓冲液。立即在流式细胞仪(FACSAria，Becton Dickinson，USA)上对样品进行分析。实验结果重复3次。

1.6样本 本研究经石河子大学医学院第一附属医院肿瘤科伦理委员会批准，参与者均签署书面知情同意书。招募了2013年1月至2014年1月石河子大学医学院第一附属医院肿瘤内科收治的NSCLC患者。收集肺癌患者外周血标本(男13例，女27例，年龄30～79岁，中位年龄60.5岁)。使用中位数将患者分为PDCD5高表达组和PDCD5低表达组，给予铂类药物与其他化疗药物用于化疗。治疗周期为21 d，包括4个周期。样本采集前患者均未接受化疗、放疗、手术治疗或生物治疗。患者的诊断均为活检所证实。治疗前影像学研究，采用美国癌症分期系统联合委员会〔13〕进行组织学分级，临床分期按照TNM标准〔14〕进行。将样本凝结30 min，然后离心10 min，将所有样本冷冻储存在-80℃，直到试验。

1.7ELISA法检测血清PDCD5蛋白表达 用ELISA试剂盒测定患者血清中PDCD5蛋白的表达。设立空白孔、标准品孔和样本反应孔。以标准品稀释溶液作为空白。37℃下培养2 h，然后抽吸和添加100 μl制备的检测试剂A并在37℃温育1 h，将其吸出并洗涤3次。接下来加入100 μl制备的检测试剂B并在37℃下温育30 min，然后吸出并洗涤5次。随后加入90 μl底物溶液，在37℃温育25 min。最后，添加50 μl终止液，立即读取450 nm波长处的OD值。

1.8统计学方法 使用SPSS17.0软件进行单因素方差分析、Pearson分析、χ2检验。

2 结 果

2.1不同浓度的PDCD5蛋白处理后A549细胞中PDCD5蛋白表达上调 随着rhPDCD5蛋白浓度的增加，PDCD5蛋白表达在A549细胞中表达上调，对照组、顺铂组、rhPDCD5 A组、rhPDCD5 B组PDCD5蛋白表达分别为：(0.269±0.000)pg/ml、(0.111±0.002)pg/ml、(0.123±0.009)pg/ml、(0.157±0.009)pg/ml，差异有统计学意义(F=284.321，P<0.001)。

2.2rhPDCD5增强顺铂诱导的A549细胞生长停滞 与顺铂组相比，rhPDCD5 A组和B组增殖抑制率显著更高，且这种效应呈剂量和时间依赖性。见表1。

表1 rhPDCD5增强顺铂诱导的A549细胞的增殖抑制率

2.3顺铂处理后rhPDCD5蛋白促进A549细胞凋亡 各组细胞凋亡率分别为：对照组(6.56±0.49)%，顺铂组(22.31±0.64)%，rhPDCD5 A组(43.30±0.62)%，rhPDCD5 B组(64.25±0.54)%，各组细胞凋亡率差异有统计学意义(F=1 908.87，P<0.001)。不同剂量PDCD5(15和30 μg/ml)与顺铂联合应用细胞凋亡率协同增加，并且呈剂量依赖性。见图1。

图1 rhPDCD5促进顺铂诱导的A549细胞凋亡

2.4PDCD5蛋白存在于NSCLC患者中 PDCD5蛋白表达与年龄或性别无显著相关性，但与吸烟、TNM分期和淋巴结转移显著相关。

2.5rhPDCD5蛋白增强了NSCLC患者顺铂的抗肿瘤活性 对于铂类化疗药物，较高的表达效率为80%(16/20)，而较低的表达效率为45%(9/20)，差异具有统计学意义(表2)。

表2 根据临床病理学特征和小细胞肺癌患者的治疗效果的PDCD5蛋白的表达(n)

3 讨 论

NSCLC治疗方案的选择取决于疾病的阶段、表现状态。对于晚期患者来说，化疗可能是唯一可选的治疗方式。尽管对顺铂耐药性的改善是NSCLC患者长期治疗需要克服的重要的障碍〔4〕，顺铂仍是NSCLC患者最有效的治疗方法之一，增强NSCLC细胞对顺铂敏感性的因素可能会突出治疗的预测性生物标志物或靶点。

PDCD5在细胞凋亡和细胞周期中起重要作用。据报道〔14〕，健康肺组织中的PDCD5蛋白表达量高于肺癌组织。研究发现，PDCD5过表达可诱导肺癌细胞系A549凋亡〔15〕。此外，在培养基中加入外源性rhPDCD5可以增强由硫酸肝素蛋白多糖结合和脂筏引发的网格蛋白独立内吞通路引起的程序性细胞死亡〔9〕。在本研究中，外源性添加不同浓度的rhPDCD5到A549培养基中，可以增加PDCD5蛋白的表达。本研究发现PDCD5蛋白可以改变肿瘤的生物学行为，提高A549细胞对顺铂的体外敏感性。有报道称PDCD5基因和PDCD5蛋白可增强胃癌细胞〔16〕、骨肉瘤细胞〔17〕、软骨肉瘤细胞〔10〕、乳腺癌细胞〔18〕、慢性粒细胞白血病细胞〔19〕、胶质瘤细胞〔20〕、肝癌细胞〔21〕对化疗的敏感性等。

本研究中，PDCD5蛋白在NSCLC中的表达降低与年龄、性别无关，与吸烟行为、TNM分期、淋巴结转移有关。有报道称PDCD5表达与年龄、性别无显著关系，但与人胃肠道间质瘤患者的肿瘤大小及有丝分裂有显著相关性〔22〕。在肝癌患者中，PDCD5的表达与乙肝病毒(HBV)感染、肿瘤数量、淋巴结转移、生存时间有显著相关性〔23〕。Xu等〔24〕在喉癌鳞状细胞癌中的报道表明，PDCD5的表达与年龄、性别、原发或淋巴结转移部位无显著相关性。

本研究发现PDCD5蛋白低表达与不良疗效呈正相关。事实上，在胶质瘤〔25〕、前列腺癌〔26〕、上皮性卵巢癌〔27〕、软骨肉瘤〔28〕患者中，PDCD5低表达与预后不良呈正相关。由于后续治疗的差异，仅观察到4个化疗周期后的疗效。

综上所述，本研究首次证实rhPDCD5对顺铂诱导的细胞毒性具有明显的致敏作用。高表达PDCD5蛋白的肺癌患者可能更适合采用以顺铂为基础的化疗。PDCD5有可能用于改善肺癌患者对顺铂化疗的反应，但尚需进一步的研究证实。