阿托伐他汀钙对冠心病患者外周血炎症因子及单核细胞极化的影响

鲁琦 李论

(武汉市第四医院 华中科技大学同济医学院附属普爱医院心血管内科，湖北 武汉 430033)

冠心病是指冠状动脉在粥样硬化的基础上发生管腔狭窄或闭塞，从而导致心肌缺血缺氧甚至坏死的心脏疾病〔1〕。据推算，我国冠心病现患人数已达1 100万例，其中心脏病死亡率为144.79/10万，且呈逐年上升阶段〔2，3〕。目前，冠心病的主要治疗方式为药物治疗。阿托伐他汀钙作为他汀类降脂药物已逐渐广泛应用于冠心病的治疗。本研究拟探讨阿托伐他汀钙对冠心病的治疗效果及其作用机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 2016年6月至2018年6月在武汉市第四医院心内科诊治的冠心病患者110例按随机数表法分为对照组及干预组各55例。纳入标准：符合美国心脏协会(AHA)、美国心脏病学会(ACC)诊断标准：左冠状动脉主干(LM)、左前降支(LAD)、左回旋支(LCX)、右冠状动脉(RCA)中至少一支冠状动脉狭窄程度≥50%；心功能Ⅰ、Ⅱ级。排除标准：发病前2个月内服用过他汀类药物；合并自身免疫性疾病或恶性肿瘤；合并严重肺部、肝肾功能不全；合并急慢性感染；近3个月内有外伤或手术史。入院时详细收集各组临床资料及辅助检查结果。本研究经武汉市第四医院伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。两组年龄、性别、吸烟史、体重指数(BMI)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高血压发生率、糖尿病发生率及冠状动脉病变累及支数比较差异均无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两组一般资料比较

1.2主要试剂 人肿瘤坏死因子(TNF)-α酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒购自武汉博士德生物有限公司，人高迁移率族蛋白(HMG)B1 ELISA检测试剂盒购自日本世诺有限公司，人单核细胞分离液试剂盒购自天津市灏洋生物制品有限公司，胎牛血清、RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，Trizol裂解液购自美国Invitrogen公司，逆转录和实时荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)试剂盒购自TaKaRa公司，二喹啉甲酸(BCA)蛋白浓度测定试剂盒、细胞及免疫沉淀(IP)裂解液购自上海碧云天生物技术有限公司，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)抗体购自美国Santa Cruz公司，精氨酸酶(Arg)-1及甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体购自美国CST公司。

1.3方法 对照组给予传统治疗方案：阿司匹林肠溶片(厂家：Bayer S.p.A.有限公司；批准文号：国药准字J20130078)，100 mg/次，1次/d，口服；及单硝酸异山梨酯片(厂家：阿斯利康制药有限公司；批准文号：国药准字H20030417)，30 mg/次，1次/d，口服。连续用药2个月。干预组在传统治疗方案的基础上加用阿托伐他汀钙片(厂家：辉瑞制药有限公司；批准文号：国药准字J20030048)，20 mg/次，1次/晚，口服。连续服药2个月。

1.4观察指标

1.4.1疗效评价 根据患者心绞痛症状发作情况评估治疗效果：显效为治疗后心绞痛发作频次降低≥80%；有效为治疗后心绞痛发作频次降低程度介于50%～79%；无效为治疗后心绞痛发作频次降低<50%〔4〕。显效率+有效率=总有效率。

1.4.2血清中TNF-α、HMGB1水平检测 于服药前及服药2个月后，所有患者空腹抽取外周血，室温、4 000 r/min离心获取血清，于-80℃储存。严格按照ELISA试剂盒说明书步骤检测血清中TNF-α及HMGB1水平。

1.4.3外周血单核细胞提取 于服药前及服药2个月后，所有患者空腹抽取外周血，将血液标本与磷酸盐缓冲液(PBS)稀释混匀，将混合液轻轻置于分离液上，于3 000 r/min、4℃条件下离心30 min。离心后出现分层，取第二层白膜细胞，PBS洗涤，获取单核细胞备用。

1.4.4RT-q-PCR法检测外周血单核细胞中iNOS、Arg-1 mRNA的表达 取1×106个单核细胞，加入1 ml Trizol，提取总RNA，测定RNA浓度及D260/D280；按照TaKaRa RR047A逆转录试剂盒说明书进行逆转录，再按照TaKaRa RR820A进行RT-qPCR检测。以GAPDH为内参，采用2-△△Ct法分别计算iNOS、Arg-1 mRNA的表达量。具体引物序列如下：iNOS上游：5′-GGAGCCAGCTCTGCATTATC-3′，下游：5′-TTTTGTCTCCAAGGGACCAG-3′；Arg-1上游：5′-CCCCAGTACCAACAGGACTACC-3′，下游：5′-TGAACGTGGCGGAATTTTGT-3′； GAPDH上游：5′-CACCCACTCCTCCACCTTTG-3′，下游：5′-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3′。

1.4.5Western印迹法检测iNOS及Arg-1的蛋白表达 取1×106个单核细胞，用细胞及IP裂解液裂解细胞并提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度，制备蛋白样品，80 V恒定电压电泳30 min后调节为120 V继续电泳90 min，切胶、转膜，5%脱脂奶粉封闭，4℃一抗过夜，TBST洗涤后二抗孵育，电化学发光显色，BioRad系统曝光，Quantity one分析图片。

1.5统计学方法 采用SPSS20.0软件进行χ2检验、t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1两组治疗后疗效比较 干预组的总体有效率显著高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组疗效比较〔n=55,n(%)〕

2.2两组治疗前后血清HMGB1及TNF-α及蛋白水平比较 治疗前，两组血清中HMGB1及TNF-α水平比较差异无统计学意义(P>0.05)。治疗后，两组HMGB1及TNF-α水平均显著下降(P<0.05)。同时，治疗后干预组HMGB1及TNF-α水平均明显低于对照组(P<0.001)。见表3。

表3 两组治疗前后血清HMGB1及TNF-α水平比较

2.3两组治疗前后外周血单核细胞中iNOS、Arg-1 mRNA及蛋白水平比较 两组治疗前，外周血单核细胞中iNOS、Arg-1 mRNA及蛋白表达水平差异均无统计学意义(P>0.05)。治疗后，两组iNOS mRNA及蛋白水平显著下降，Arg-1 mRNA及蛋白水平显著升高(均P<0.05)。治疗后干预组iNOS mRNA及蛋白水平明显低于对照组，干预组Arg-1 mRNA及蛋白水平明显高于对照组(均P<0.05)。见表4，图1。

表4 两组治疗前后外周血单核细胞中iNOS、Arg-1 mRNA及蛋白的表达水平比较

1～4：对照组治疗前，干预组治疗前，对照组治疗后，干预组治疗后图1 两组治疗前后外周血单核细胞中iNOS、Arg-1蛋白表达

3 讨 论

研究表明，炎症反应在冠心病发生发展过程中具有重要作用。李志等〔5〕发现，与正常人相比，冠心病患者血清中白细胞介素(IL)-8水平明显增高，而IL-10水平则显著降低，且炎症因子的表达与冠心病危险程度呈正相关，提示炎症反应在冠心病进程中发挥重要作用。另一项研究发现，急性心肌梗死患者血清中炎症因子IL-6及TNF-α水平显著增高，炎症反应与病情程度密切相关，在病情评估上具有一定应用价值〔6〕。因此，抑制炎症反应则可能改善冠心病的病情，延缓疾病进展。

阿托伐他汀钙除具有调脂作用外，其还具有抗炎、改善血管内皮功能、抑制血管平滑肌增殖、防止血栓形成及稳定斑块等作用〔7，8〕。对于急性脑梗死患者，阿托伐他汀可明显降低血清中炎症因子IL-6、内皮素及单核细胞趋化因子1〔9〕。阿托伐他汀还可明显调节冠心病患者血脂水平、降低血清超敏C反应蛋白及改善左室射血分数，从而有助于延缓冠状动脉粥样硬化进程〔10〕。而Zhao等〔11〕研究发现，在自发性高血压大鼠中，阿托伐他汀可明显降低血清中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α及转化生长因子β，改善肾脏病理损害，其抗炎机制可能与增加过氧化物酶体增殖激活受体-γ的表达有关。本研究也发现阿托伐他汀在冠心病上也具有良好的抗炎作用。

单核-巨噬细胞系统是人体内天然免疫系统的重要组成部分，根据其细胞表面标记物的不同，可将其分为经典活化的单核-巨噬细胞(M1型)及选择性活化的单核-巨噬细胞(M2型)〔12〕。单核-巨噬细胞极化在冠心病的发生发展过程中也发挥了重要作用〔13〕。在心肌梗死早期，心脏局部的巨噬细胞主要分化为M1型，可分泌大量炎症因子从而介导心肌细胞及内皮细胞的损伤；而在后期，巨噬细胞则向M2型转化，并促进梗死心肌的修复重塑〔14〕。研究表明，巨噬细胞极化还可参与维持冠脉中斑块稳定性的调节，M1型巨噬细胞通过分泌大量炎症因子，使得斑块内环境中基质金属蛋白酶水平上升，后者可促进斑块周围纤维基质的水解，从而降低斑块稳定性；而具有抗炎作用的M2型巨噬细胞则可抑制上述炎症反应的发生，从而维持斑块稳定性〔15〕。因此，调节巨噬细胞的M1/M2极化可作为冠心病防治的一个潜在靶点。

综上，阿托伐他汀对冠心病有治疗作用，其可促进外周血单核细胞呈M2型极化，从而发挥抗炎作用，提高治疗效果。